概要

Идентификация гемолитической и фосфолипазной активности в сырых экстрактах из морских анемонов с помощью простых биоанализов

Published: March 29, 2022
doi:

概要

Здесь мы описываем протокол получения экстракта сырого яда из морского анемона и выявления его гемолитической и фосфолипазной активности.

Abstract

Состав яда морского анемона включает полипептидные и небелковые молекулы. Цитолитические компоненты обладают высоким биотехнологическим и биомедицинским потенциалом для разработки новых молекулярных инструментов. Яд морского анемона находится в железистых клетках эктодермы и субклеточных структур, называемых нематоцистами, оба из которых распределены по всему телу морского анемона. Эта характеристика подразумевает проблемы, потому что клетки и нематоцисты должны быть лизированы для высвобождения компонентов яда с другими нетоксичными молекулами. Поэтому сначала яд получают из сырого экстракта (смесь различных и разнообразных молекул и тканевого мусора). Следующим шагом является обнаружение полипептидов со специфической биологической активностью. Здесь мы описываем эффективную стратегию получения сырого экстракта морского анемона и биоанализа для выявления присутствия цитолизинов. Первый шаг включает в себя недорогие и простые методы (цикл перемешивания и замораживания-оттаивания) для высвобождения цитолизинов. Мы получили самую высокую цитолитическую активность и белок (~500 мг белка из 20 г сухого веса). Далее полипептидную сложность экстракта анализировали с помощью геля SDS-PAGE, детектирующего белки с молекулярной массой от 10 кДа до 250 кДа. В гемолитическом анализе мы использовали эритроциты овец и определяли HU50 (11,1 ± 0,3 мкг/мл). Напротив, наличие фосфолипаз в сыром экстракте определяли с помощью яичного желтка в качестве субстрата в твердой среде с агарозой. В целом, это исследование использует эффективный и недорогой протокол для приготовления сырого экстракта и применяет воспроизводимые биоанализы для идентификации цитолизинов, молекул с биотехнологическими и биомедицинскими интересами.

Introduction

Морские животные являются богатым источником биологически активных соединений. В последние десятилетия состав яда морского анемона привлек научное внимание, поскольку он включает в себя разнообразие полипептидов с гемолитической, цитотоксической, ферментативной (фосфолипаза, протеаза, хитиназа) и нейротоксической активностью и ингибирующим действием на протеолитическую активность1. Кроме того, эти полипептиды являются потенциальными источниками для разработки молекулярных инструментов в биотехнологическом и терапевтическом использовании 2,3.

Существует мало сообщений о яде морского анемона и его молекулярных компонентах из-за сложности получения яда, даже выделения и характеристики токсинов. Методы экстракции, используемые в отчетах, включали лизис и опорожнение содержимого клеток, которые связаны и не связаны с производством яда1.

Особой характеристикой у всех книдарианцев является отсутствие системы производства и высвобождения яда, централизованной в единой анатомической области. Вместо этого нематоцисты представляют собой структуры, которые удерживают яд 4,5. Другие типы клеток, называемые клетками эпидермальной железы, также выделяют токсины и также распределяются по всему телу морских анемонов6.

Первой и наиболее важной проблемой в получении яда является генерация экстракта с достаточными манипуляциями в последующих процессах, без инактивации или деградации лабильных белков. Далее клетки должны быть лизированы, а компоненты — в данном случае полипептиды — должны быть эффективно и быстро экстрагированы, избегая протеолиза и гидролиза при одновременном устранении других клеточных компонентов7.

Для получения сырого экстракта морского анемона используются различные методы; некоторые из них связаны с принесением в жертву организма, в то время как другие позволяют сохранить его живым. Методы, которые подразумевают использование всего тела организма, позволяют высвобождать большинство токсинов из яда8, по сравнению с методами, которые поддерживают жизнь организмов, которые извлекают только некоторые компоненты яда9. Приготовление экстракта требует оценки присутствия и эффективности вещества, представляющего интерес, посредством специфического биоанализа, который включает в себя стратегии наблюдения фармакологических эффектов методами in vivo или in vitro 10.

Яд морского анемона содержит цитолитические полипептиды, порообразующие токсины (ПФТ)11 и фосфолипазы12; эти молекулы являются моделями в изучении белково-липидного взаимодействия, молекулярными инструментами в терапии рака и биосенсорами на основе нанопор3. Классификация ФФТ морских анемонов проводится по их размерам или молекулярной массе, от 5 кДа до 80 кДа. PFT 20 кДа, наиболее изученный и известный как актинопорины11, представляет особый интерес из-за его биомедицинского потенциала в разработке молекулярных инструментов для возможных применений в качестве противоопухолевых, противомикробных и нанопоровых биосенсоров. Другой цитолизин, включая фосфолипазы, в частности фосфолипазу A2 (PLA2)13, высвобождает жирную кислоту и гидролизует фосфолипиды, дестабилизируя клеточную мембрану. Благодаря такому механизму действия PLA2 обещает стать важной моделью для изучения и применения при воспалительных заболеваниях. Он может служить моделью для исследований поведения липидов в клеточной мембране14.

Здесь мы описываем эффективный протокол получения сырого экстракта из морского анемона Anthopleura dowii Verrill, 1869, и обнаружения гемолизинов и фосфолипаз. Оба являются релевантными токсинами, которые могут быть использованы в качестве шаблона для разработки новых молекулярных инструментов.

Protocol

Морские анемоны были собраны в соответствии с руководящими принципами Национальной комиссии по аквакультуре, рыболовству и продовольствию федерального правительства Мексики (номер разрешения PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Комитет по биоэтике Института биотехнологии Национального автономного ?…

Representative Results

Репрезентативные результаты протокола, использованные для получения сырого экстракта морского анемона, показали, что сочетание двух методов (перемешивание и циклы замораживания и оттаивания) приводило к эффективному разгрузке нематоцист, а общее количество белка составляло 500 мг (8 м?…

Discussion

Высокий спрос на новые соединения с применением в различных областях науки и промышленности привел к изучению яда. Яд представляет собой богатый источник молекул, который служит шаблоном для генерации новых молекулярных инструментов. Однако сложность этих ядов требует реализации и с?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Программой апойо проекта исследований и инноваций в области технологий (PAPIIT) с номером гранта IT200819. Авторы выражают признательность Тому Масселману, Rock Paper Editing, LLC, за проверку английской грамматики этой рукописи; и техническая помощь Саманты Хименес (СИСЕСЕ, Энсенада) и Хуана Мануэля Барбосы Кастильо (Институт физики Селулара, УНАМ). Мы также благодарим д-ра Аугусто Сезара Лизаразо Чапарро (CEPIPSA) за получение овечьей крови. Мы особенно благодарим д-ра Хосе Санигера Блесу, ICAT-UNAM, за оборудование в его лаборатории для видеозаписи.

Materials

15 mL conical centrifuge tube Corning 430766
2-Bromophenol blue Sigma B75808
2-mercaptoetanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
50 mL conical centrifuge tubes Corning 430828
Acetic Acid Glacial J.T. Baker 9515-03
Acrylamide Promega V3115
Agarose Promega V3125
Bisacrylamide Promega V3143
Bovine Serum Albumin Fraction V Sigma A3059-100G
Bradford Protein Assays Bio-Rad 5000006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C3306
Cell culture plates 96 well, V-bottom Corning 3894
Centrifuge Eppendorf 5804R
Centrifuge tubes Corning CLS430829
ChemiDoc MP system Bio-Rad 1708280
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
Clear flat.bottom 96-Well Plates Thermo Scientific 3855
Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio-Rad #1610406
Coomassie brilliant blue R-250 Bio-Rad 1610400
Dextrose J.T. Baker 1916-01
Ductless Enclosure Labconco Vertical https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ Bio Rad. Gel Documentation System
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-4L
Hemocytometer Marienfeld 650030
ImageJ (Software) NIH, USA Version 1.53c
Incubator 211 Labnet I5211 DS
Methanol J.T. Baker 9049-03
Mini-PROTEAN tetra cell Bio-Rad 1658000EDU
Na2HPO4 J.T. Baker 3824-01
NaCl J.T. Baker 3624-01
NaH2PO4.H2O J.T. Baker 3818-05
Origin software version 9 To design the plot with sigmoidal adjustments
Petridish Falcon 351007
Pipetman kit Gilson F167380
Precast mini gel BioRad 1658004
Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26620
Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 252433
SDS Sigma-Aldrich L4509
Sodium citrate dihydrate JT Baker 3646-01
Spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC G10S UV-VIS
Tris Base Sigma-Aldrich 77-86-1
Volt Power Supply Hoefer PS300B

参考文献

  1. Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
  2. Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
  3. Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
  4. Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
  5. Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).
  6. Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
  7. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
  8. Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
  9. Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
  10. Hader, D., Erzinger, G. . Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).
  11. Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
  12. Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
  13. Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis – its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
  14. Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  17. Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
  18. Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
  19. Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
  20. de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
  21. Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
  22. Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
  23. Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
  24. Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
  25. Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
  26. Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).

Play Video

記事を引用
Ramírez-Carreto, S., Salazar-García, S. I., Macías Martínez, G., Rodríguez-Almazán, C. Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays. J. Vis. Exp. (181), e63630, doi:10.3791/63630 (2022).

View Video