这里介绍的方案允许在免疫功能正常的小鼠中通过经鼻途径将诱导多能干细胞衍生的人小胶质细胞(iPSMG)移植到大脑中。图中显示了用于制备和经鼻移植细胞以及施用细胞因子混合物以维持iPSMG的方法。
小胶质细胞是大脑巨噬细胞样细胞的特殊群体。它们在生理和病理大脑功能中起着至关重要的作用。我们目前对小胶质细胞的大部分理解都是基于在小鼠中进行的实验。人类小胶质细胞与小鼠小胶质细胞不同,因此小鼠小胶质细胞的反应和特征可能并不总是代表人类小胶质细胞的反应和特征。此外,由于伦理和技术上的困难,对人小胶质细胞的研究仅限于 体外 培养系统,其 在体内 不屈服于小胶质细胞的特征。为了克服这些问题,开发了一种简化的方法,通过使用集落刺激因子1受体(CSF1R)拮抗剂,通过经鼻途径与内源性小胶质细胞的药理学消耗相结合,将诱导的多能干细胞衍生的人小胶质细胞(iPSMG)移植到免疫功能正常的小鼠大脑中。该协议提供了一种非侵入性地将细胞移植到小鼠大脑中的方法,因此对于评估人类小胶质细胞在生理和病理脑功能中的 体内 作用可能是有价值的。
小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)中巨噬细胞样细胞的特化群体,在控制各种大脑功能(如神经回路发育,调节神经传递和维持大脑稳态)方面起着至关重要的作用1,2,3。虽然小鼠小胶质细胞与人类小胶质细胞具有许多功能,但它们显示出物种特异性差异。因此,小鼠小胶质细胞对各种刺激的反应可能并不总是代表人类小胶质细胞4,5,6。虽然许多研究已经分析了人类小胶质细胞,但这些实验仅限于体外研究。体外培养的人小胶质细胞显示出与体内非常不同的形态特征和基因表达。因此,体外实验可能并不总是屈服于人小胶质细胞的体内特征。因此,需要一个实验系统来研究体内的人类小胶质细胞。
最近,为了研究人小胶质细胞的体内特性,体外生成的诱导多能干细胞(iPSCs)或胚胎干细胞衍生的人小胶质细胞被手术移植到小鼠大脑7、8、9、10、11、12、13、14中。使用这种方法,已经表征了人类小胶质细胞的各种体内特征。但是,由于两个原因,这种方法的广泛使用受到限制。首先是对免疫缺陷小鼠的需求。因此,为了研究人类小胶质细胞在各种神经退行性疾病中的作用,携带疾病突变的小鼠必须杂交成免疫缺陷小鼠,这需要大量的时间和精力。此外,在各种神经系统疾病中,外周免疫细胞,如T细胞,可以调节小胶质细胞功能15,16,17。因此,在免疫缺陷小鼠中进行的实验可能无法代表人小胶质细胞在体内的真正特征。其次,移植小胶质细胞的侵入性手术需要额外的设备和培训。此外,侵入性移植期间的脑损伤可能会改变小胶质细胞表型。
在该协议中,描述了iPSMG的非侵入性经鼻移植(Tsn)到免疫功能正常的野生型小鼠中的18。结合CSF1R拮抗剂PLX5622的药理学ON / OFF,其消耗内源性小鼠小胶质细胞19 和Tsn,iPSMG可以无创地移植到小鼠大脑中。此外,随着外源性人细胞因子的应用,移植的iPSMG在没有任何免疫抑制剂的情况下以区域特异性方式保持存活60天。
这里的协议描述了iPSMG的非侵入性移植到小鼠大脑中。目前方案的独特之处在于,通过结合药理学PLX ON/OFF方法和鼻内移植,iPSMG可以无创地移植到免疫功能正常的小鼠大脑中。移植的iPSMG通过占据空置的壁龛长达60天但不在皮质中形成海马体和小脑中的大多数小胶质细胞。
iPSMG高效Tsn的关键点是(i)内源性小鼠小胶质细胞的消耗效率(ii)每12小时施用一次人细胞因子。小胶质细胞在大脑中保持自己的领土。需要有效消耗小鼠小胶质细胞,以便为移植iPSMG的植入提供利基。当内源性小鼠小胶质细胞的耗竭不足时,未观察到iPSMG对小鼠海马体和小脑的定植。小胶质细胞的存活率取决于CSF1R和TGFBR信号传导19,21,22。据报道,hCSF1选择性地增加人小胶质细胞的活力,并且hTGF-β1是小胶质细胞活力所必需的,并且每12小时施用一次可抑制炎症21,23,24。在没有外源性人类细胞因子的情况下,在小鼠大脑中未观察到iPSMG。此外,在Tsn之前,必须注意不要通过过度移液或任何其他方式机械地激活iPSMG,因为它不可逆转地改变了iPSMG特性以及移植效率。如果没有看到 iPSMG 令人满意的 Tsn,则必须确定移植前 iPSMG 的生存能力以及内源性小胶质细胞的耗竭。如果内源性小鼠小胶质细胞的耗竭不超过90%,可以修改PLX5622的进食时间以增加耗竭。
与传统的侵入性手术移植方法相比,Tsn允许以非侵入性,简单,稳定和容易的方式进行移植。此外,该方法允许将iPSMG移植到免疫功能正常的小鼠大脑中;因此,免疫功能正常的疾病模型小鼠可用于研究iPSMG的反应。
目前该方法的最大缺点是iPSMG嫁接的区域异质性。如果需要进行脑区域特异性iPSMG移植,则目前的方案不合适,因为移植的iPSMG仅在海马体和小脑中保持移植60天,而在皮层中不移植。此外,需要每12小时鼻内施用外源性人细胞因子也是当前方案的局限性,因为它需要大量的劳动力并且价格昂贵。
总之,提供了将iPSMG的Tsn放入免疫功能小鼠大脑的详细方案。当通过PLX5622与小鼠小胶质细胞的药理学开/关相结合时,该方案允许成功移植iPSMG。由于当应用外源性细胞因子时,可以在海马体和小脑中持续观察移植细胞,因此当前的方法对于评估人类小胶质细胞在这些区域的生理和病理状态中的作用可能是有价值的。
The authors have nothing to disclose.
资助赞助商:本研究由JSPS KAKENHI 17K14961(PB),20K15899(PB),JP18K06481(YS),JP20KK0366(YS),20H05902(SK),20H05060(SK),19H04746(SK),21H04786(SK),21K19309(SK),AMED-CREST(SK),CREST(SK),三菱科学基金会(SK),武田科学基金会(SK)和山梨大学(SK)的前沿脑科学基金(SK)支持。
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10566 | |
AIN 93G | Oriental Yeast Co | ||
Anti-Iba1 antibody | FUJIFILM | 019–19741 | |
Anti-STEM121 antibody | Takara Bioscience | Y40410 | |
Butorphanol tartrate | Kyoritsu Seiyaku | 8019 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | |
Frozen iPSMG | Shionogi & Co., Ltd | Laboratory for Drug Discovery and Disease Research | |
Human colony stimulating factor 1 (hCSF1) | PeproTech | 300-25 | |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 | |
Medetomidine hydrochloride | Meiji Seika | VETLI5 | |
Midazolam | Astellas | 18005A2 | |
Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 162-16065 | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
Pipette tip | Eppendorf | 30076028 | |
PLX5622 | Amadis Chemical | A930097 | |
Transforming growth factor-β1 (Tgf-b1) | PeproTech | 100-21 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400-10 | antifade mounting medium |