3D 오가노이드 배양물을 확립하기 위해 송곳니 장 및 간 조직으로부터 성체 줄기 세포를 수확하는 실험 방법이 기재되어 있다. 또한, 일관된 성장을 보장하고 수확, 바이오 뱅크 및 개 장 및 간 오가노이드 배양을 부활시키기위한 표준 운영 절차를 제공하기위한 실험실 기술이 논의됩니다.
개는 염증성 질환, 대사성 질환 및 암을 포함하여 인간과 유사한 복잡한 다인자 질환을 발병합니다. 따라서 그들은 인간 의학에 대한 번역 잠재력을 가진 관련 대형 동물 모델을 대표합니다. 오가노이드는 3차원(3D), 그들의 기원 기관의 미세해부학 및 생리학을 모방하는 줄기세포로부터 유래된 자기조립 구조이다. 이러한 번역적 시험관내 모델은 약물 투과성 및 발견 응용, 독성학 평가, 및 다인자성 만성 질환의 병태생리학에 대한 기계론적 이해를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 송곳니 오가노이드는 반려견의 삶을 향상시켜 수의학 연구의 다양한 분야에 대한 의견을 제공하고 수의학에서 개인화 된 치료 응용 프로그램을 촉진 할 수 있습니다. 소그룹의 기증자는 오가노이드 샘플의 바이오 뱅크를 만들 수 있으며, 오가노이드 세포주가 무기한으로 계대 배양 될 수 있기 때문에 지속적인 조직 수확의 필요성을 줄일 수 있습니다. 본원에서, 성체 줄기 세포로부터 유래된 장 및 간 송곳니 오가노이드의 배양에 초점을 맞추는 세 가지 프로토콜이 제시된다. 송곳니 오가노이드 분리 프로토콜은 조직을 처리하고 세포를 지지하는 매트릭스 (가용화 된 세포외 막 매트릭스)에 격리하는 방법을 설명합니다. 송곳니 오가노이드 유지 보수 프로토콜은 확장을위한 적절한 타이밍과 함께 청소 및 통과를 포함하여 오가노이드 성장 및 유지 보수를 설명합니다. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol은 추가 분석을 위해 오가노이드를 추출, 동결 및 보존하는 방법을 설명합니다.
설치류는 생물 의학 및 번역 연구에 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델입니다1. 그들은 만성 다인자 질환에 대한 임상 적 관련성이 최근에 의문을 제기하고 있지만, 질병의 기본 분자 병인을 조사하는 데 매우 유용합니다2. 송곳니 모델은 설치류와 비교하여 몇 가지 장점을 나타냅니다.3,4. 개와 인간은 가축화의 다양한 기간 동안 인간의 식단 섭취로 인해 개발 된 대사체학 및 장내 미생물의 유사성을 공유합니다5,6,7. 송곳니와 인간의 위장 해부학 및 생리학 사이의 유사성은 또 다른 예입니다8.
또한, 개들은 종종 주인과 비슷한 환경과 생활 방식을 공유합니다9. 설치류에 비해 개들의 수명이 길수록 수많은 만성 질환의 자연 발달이 가능합니다10. 염증성 장 질환 또는 대사 증후군은 인간과 개 사이에 중요한 유사성을 공유하는 다인자성 만성 질환의 예이다11,12. 자연적으로 발생하는 질병을 앓고있는 개를 포함하는 송곳니 전임상 시험은 설치류 모델에서 얻은 것보다 더 신뢰할 수있는 데이터를 생성 할 수 있습니다13. 그러나, 살아있는 동물 연구의 사용을 최소화하고 3Rs(Reduce, Refine, Replace)14의 원칙을 준수하기 위해, 3D 시험관내 송곳니 오가노이드를 이용한 생체내 시험에 대한 대안이 등장하였다15.
오가노이드는 원래 장기의 생리학 및 미세 해부학을 재구성하는 자체 조립 된 3D 줄기 세포 유래 구조입니다16,17. 이 기술은 200917 년 Sato et al.에 의해 처음 기술되었으며 2D 암 세포 배양물을 사용하여 이전에 가능했던 것보다 상피 세포주에서 더 많은 번역 가능한 시험관 내 연구를 허용했습니다18,19,20. 오가노이드는 전임상 독성학21,22,23, 흡수 또는 대사 연구 24,25,26,27,28뿐만 아니라 개인화 된 의학적 접근법과 같은 많은 생물 의학 분야에서 시험관 내 모델에서 유용합니다.29,30,31 . 송곳니 장 오가노이드의 성공적인 배양은 201912 년에 처음으로 기술되었으며, 개에서 유래 한 간 오가노이드는 201532 년 Nantasanti et al.에 의해 처음보고되었습니다. 송곳니 오가노이드는 이후 송곳니 만성 장병증, 위장관 기질 종양, 대장 선암종12 및 윌슨병33,34를 조사하는 연구에 성공적으로 사용되었습니다.
성체 줄기 세포는 부검을 통해 수확 될 수 있지만, 오가노이드 기술은 항상 동물을 희생 할 필요는 없습니다. 내시경 및 복강경 생검, 또는 심지어 장기의 미세바늘 흡인물35은 상피 오가노이드 분리를 위한 성체 줄기 세포의 실행 가능한 공급원이다12. 수의학 실습에서 이러한 비 침습적 기술의 광범위한 사용은 역 번역 연구 (수의학 임상 실습에서 인간 임상 실습으로 또는 그 반대의 경우도 마찬가지)를위한 옵션을 용이하게합니다 15. 오가노이드 기술의 발전은 오가노이드 배양 및 유지 보수 방법의 표준화에 의해 보장 될 수 있습니다. 여기에 제시된 오가노이드 프로토콜은 부분적으로 201536 년 Saxena et al.의 이전에 발표 된 연구를 기반으로하며, 방법은 송곳니 장 및 간 오가노이드 배양의 특이성에 맞게 조정되었습니다. 송곳니 오가노이드 프로토콜의 전체 워크플로우는 그림 1에 묘사되어 있습니다.
송곳니 오가노이드 분리 프로토콜은 내시경, 복강경 및 외과 생검 및 부검에서 샘플을 얻는 방법을 소개합니다. 그것은 실험실로 수송하는 데 사용되는 조직 샘플과 방법론의 초기 전처리를 설명합니다. 오가노이드 분리에 필요한 재료 및 시약은 ‘분리 준비’섹션에 요약되어 있습니다. 조직 샘플로부터 성체 줄기세포를 분리하는 과정은 추가로 상세히 설명된다. 마지막으로, 가용화된 세포외 막 매트릭스를 사용하여 오가노이드를 돔형 구조로 도금하는 과정이 논의된다.
두 번째 프로토콜 인 Canine Organoid Maintenance Protocol은 오가노이드를 문서화하고 배양하는 방법을 설명합니다. 미디어 변경 사항 및 빈도에 대해서는 이 섹션에서 설명합니다. 또한, 3D 송곳니 오가노이드의 성공적인 유지를 보장하는 데 필수적인 세포 배양물을 통과 및 청소하는 것과 같은 실험실 절차가 설명됩니다. 적절한 통과는 프로토콜의 중요한 단계이며,이 단계의 가능한 조정 및 문제 해결은 원고에서 더 자세히 논의됩니다.
마지막 프로토콜은 파라핀 임베딩 및 RNA 보존을 위해 완전히 자란 오가노이드를 준비하는 방법을 포함하는 송곳니 오가노이드 수확 및 바이오 뱅킹 프로토콜입니다. 액체 질소 저장소에서 오가노이드 샘플을 바이오뱅킹하는 방법 또한 여기에 기재되어 있다. 마지막으로, 냉동 샘플을 해동하고 성장을 지원하는 방법이 논의됩니다.
결론적으로,이 기사는 실험실 간 프로토콜의 표준화를 통해 일관된 송곳니 오가노이드 배양 절차를 제공하는 것을 목표로합니다. 이를 통해 원고는 송곳니 오가노이드 모델에서 파생 된 데이터의 재현성을 촉진하여 번역 생물 의학 연구에서의 관련성을 높이는 것을 목표로합니다.
그림 1: 송곳니 오가노이드 프로토콜의 워크플로우. 송곳니 오가노이드 분리 프로토콜은 오가노이드 분리에 필요한 재료의 준비, 조직 샘플의 수확 (부검, 내시경, 복강경 및 외과 생검 수단을 통해) 및 세포 집단의 세포 해리 및 도금에 대한 지침을 설명합니다. 송곳니 오가노이드 유지 보수 프로토콜은 오가노이드 문화의 청소 및 통과에 대해 논의합니다. 오가노이드 수확 및 바이오뱅킹 프로토콜은 파라핀 임베딩 및 추가 오가노이드 특성화를 위한 오가노이드 샘플의 준비에 대해 논의합니다. 유기 세포 배양물을 바이오 뱅크하고 액체 질소의 저장에서 부활시키는 방법도 논의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
현재 송곳니 간 및 장 오가노이드의 분리 및 유지에 사용할 수있는 표준화 된 프로토콜이 부족합니다. 오가노이드 배양에 대한 표준 운영 절차를 수립하는 것은이 모델이 다른 실험실 환경에서 적용 될 수 있도록 보증됩니다. 특히, 이러한 송곳니 오가노이드 모델의 배양을 위한 표준화된 작동 프로토콜을 제공하는 것은 확장 및 유지를 위한 최적의 시점을 도출하기 위해 배양 및 패시징 동안 오가노이드의 정상적인 성장을 특성화하는 데 핵심입니다. 상기 프로토콜을 사용하여 배양된 송곳니 장내 오가노이드는 이전에 Chandra et al.12에 의해 특성화되었다.
프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 오가노이드의 통과입니다. 간 구상체의 첫 번째 통과에 대한 최적 시간은 간 스페로이드 측정에 기초하여 분리 후 7 일째로 결정되었다. 구상체의 최대 부피는 7 일째까지 달성되었으며, 동시에 구상체가 싹을 틔우기 시작하여 간 오가노이드를 형성했습니다. 단리 후 2-7일째부터 전체 오가노이드 부피의 증가는 365배 이상이었으며, 이는 최적의 통과 시간이 송곳니 장내 오가노이드 배양물보다 더 길다는 것을 시사한다. 배양 7일 후, 세척 또는 계류 없이도 간 스페로이드에서 세포 사멸의 총체적인 징후가 관찰되지 않았다(도 7). 장 및 간 오가노이드를 통과시키는 것은 절차가 세포의 손실과 변화된 생존력으로 이어질 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 결과는 트립신-유사 프로테아제를 사용한 간 오가노이드의 장기간 배양(최대 12분)이 계대 배양에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 오가노이드를 트립신 유사 프로테아제에서 24분 이상 인큐베이션하는 것은 오가노이드의 후속 계대배양에 해로울 수 있다.
오가노이드 통로가있는 세포 클러스터에서 차선책의 파손의 경우, 트립신과 같은 프로테아제를 사용한 장기간의 배양 대신 기계적 해리가 더 유익 할 수 있습니다. 오가노이드의 적절한 해리와 함께 문제가 발생하면 통과 수율을 향상시키기 위해 샘플의 간단한 볼텍싱이 시도 될 수 있습니다. 반면에 볼텍싱은 배양을 망치고 세포를 손상시킬 가능성이 있으므로 다른 절차가 반복적으로 실패한 경우에만 사용해야합니다. 간 오가노이드를 단일 세포로 분해하면 오가노이드의 성장 속도가 낮아지고 세포 클러스터로 분해하면 생존력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 십분은 오가노이드 프로토콜에 대한 인큐베이션 시간으로서 선택되었다. 12분 인큐베이션 시점은 트립신 유사 프로테아제 실험에서 24분 인큐베이션에 비해 세포독성이 없는 것으로 간주되었다.
생존 가능성 실험은 송곳니 간 오가노이드가 불리한 조건 (구조적 및 영양 고갈)에서 최대 19.5 일 동안 생존 할 수 있음을 확인했습니다. 이러한 조건에서 가장 오래 살아남은 오가노이드는 CMGF+ 배지로 배양되었다. 이 관찰은 Rock 억제제 및 GSK3β로 보충되지 않은 배지에서 간 오가노이드의 느린 성장으로 인해 발생했을 수 있습니다. CMGF+ R/G를 이용한 오가노이드 문화는 더 빠르게 성장했고 자원을 더 빨리 고갈시켰을 수도 있다. 이 실험은 송곳니 오가노이드 배양을 소형화하여 높은 처리량의 시스템 변환을 달성 할 수있는 가능성을 열어줍니다. 이러한 기술은 실질적으로 감소된 비용으로 약물 발견 또는 독성학 연구를 용이하게 할 수 있는 잠재력을 보여준다.
송곳니 오가노이드 배양 유지 보수 중에 발생하는 몇 가지 일반적인 문제는 도금시 부적절한 샘플 응고, 배양 오염 및 오가노이드의 적절한 밀도와 크기를 확립하는 것입니다. 가용화된 ECM이 도금 중에 조기에 응고되면 즉시 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 가용화된 ECM이 돔형 구조를 형성하지 않으면, 샘플로부터 충분한 매질이 제거되지 않았을 가능성이 있다. 이 경우 돔이 형성 될 때까지 샘플을 더 가용화 된 ECM으로 희석하십시오.
곰팡이 또는 박테리아 오염이 전체 플레이트에서 발견되면 ( 그림 4 참조), 가장 좋은 해결책은 플레이트를 버리는 것입니다. 항진균제 또는 항생제로 치료할 수는 있지만 그러한 시도의 성공은 매우 낮습니다. 단일 웰이 플레이트에 오염되면, 실행 가능하고 영향을받지 않는 웰을 새 플레이트로 청소하고 (4.1 ~ 4.5 단계를 따르십시오) 면밀히 모니터링 할 수 있습니다. 샘플이 이미 비상 냉동 된 경우 샘플을 해동하면 인큐베이터가 추가 오염 위험에 노출되므로 전체 샘플을 버리는 것이 좋습니다.
건강한 오가노이드 배양은 적어도 배지 크기 및 중간 밀도 범주 또는 그 이상이어야 한다. 최적의 밀도는 오가노이드 배양 성장에 매우 중요합니다. 낮은 밀도는 오가노이드를 중간 밀도로 청소하여 수정해야합니다. 극단적 인 밀도의 상황이 발생하면 (과밀), 오가노이드는 더 많은 우물로 확장되어야합니다. 세포 아폽토시스의 총체적인 징후는 종종 오가노이드 문화의 과밀과 낮은 밀도를 동반합니다. 이러한 문제가 제 시간에 시정되지 않으면 전체 오가노이드 문화가 며칠 만에 사멸 적으로 변할 것입니다. 오가노이드가 매우 큰 크기 또는 매우 높은 밀도를 달성하는 경우, 배양물은 실험, 동결 또는 고정에 사용되어야합니다.
오가노이드 배지에는 현재 17 가지 구성 요소가 포함되어 있으므로 오가노이드 유지 및 확장에 필요한 성장 인자를 추가하는 것은 비용이 많이 들 수 있습니다. 이 문제는 조건화 된 CMGF +를 생산하기 위해 성장 인자를 합성하는 2D 세포 배양물을 성장시킴으로써 해결 될 수 있습니다. 세포 배양 L-WRN은 Wnt-3a, R-Spondin-3 및 Noggin 성장 인자37을 생산한다. 세포 콜로니는 90% DMEM/F12 및 10% FBS 배양 배지를 사용합니다. 문화가 90 %의 합류율을 달성하면 미디어는 1 주 동안 매일 수확됩니다. 수확 된 배지는 2x CMGF + (이러한 성장 인자 없음)와 혼합됩니다. 2D 배양은 비용의 일부만으로 필요한 성장 인자를 생산할 수 있지만 미디어를 생산하기위한 추가 시간과 준비가 예상되어야합니다. 조건화된 배지 배치 사이의 성장 인자의 농도는 또한 다를 수 있다37,38.
송곳니 성인 줄기 세포 유래 오가노이드 배양은 One Health Initiative39의 목표를 달성하는 데 도움이되는 독특한 생물 의학 모델입니다. 오가노이드 기술은 발달 생물학, 병리 생리학, 약물 발견 및 테스트, 독성학에서 전염병 및 재생 의학 연구에 이르기까지 많은 기본 및 생물 의학 연구 분야에서 사용될 수 있습니다40. 번역 및 역번역 연구는 송곳니 오가노이드가 적용 가능한 영역입니다15. 개는 번역 실험 환경에서 수세기 동안 사용되어 왔으며, 동반자 동물 지위는 수의학에서 가장 많이 탐구 된 종 중 하나로서의 입지를 촉진했습니다.
결론적으로,이 원고는 다양한 생물 의학 분야에서이 모델의 적용을 용이하게하기 위해 송곳니 간 및 장 오가노이드의 분리, 유지 보수, 수확 및 바이오 뱅킹을위한 표준화 된 운영 프로토콜을 제공합니다. 이 모델은 지식의 학제 간 및 학제 내 공유를 촉진하기위한 One Health Initiative의 도구로서 역 번역 연구를 촉진하는 데 독특하게 적합합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자들은 아이오와 주립 대학 직원의 수의학 진단 실험실, 즉 헤일리 M. 램버트, 에밀리 라헤, 로잘린 M. 브라나만, 빅토리아 J. 그린, 제니퍼 M. 그로엘츠-아구창에게 제공된 샘플의 적시 처리에 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 교수진 스타트업, ISU VPR 밀러 상, ISU VPR 밀러 어워드, NSF SBIR 하위 어워드에서 ISU # 1912948에 대한 지원을 인정하고자 합니다.
Chelating solution | |||
D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
DTT | Promega | V3151 | |
KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
Organoid media | |||
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
FBS | Corning | 35-010-CV | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
Reagents | |||
Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
その他 | |||
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |