Высокомасштабируемый подход к проведению экологических исследований самоуправляемых нематод caenorhabditis

1. Подготовка коллекции Определите место для обследования нематод Caenorhabditis .ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве регионов с умеренным климатом C. elegans и C. briggsae могут быть легко изолированы от связанных с человеком мест обитания, таких как сельскохозяйственные поля или сельские и городские сады1. В субтропических и тропических регионах C. briggsae, C. elegans и C. tropicalis можно найти в связанных с человеком местах обитания, перечисленных выше, иногда в непосредственной близости друг от друга. Тем не менее, C. elegans, по-видимому, предпочитает более прохладные и сухие места обитания, чем другие виды в тропических местах обитания7,8. Каждый из видов также может быть изолирован от диких мест обитания, которые не связаны с людьми, но эти места обитания отбираются реже. Создайте проект Fulcrum для организации сбора и изоляции данных с помощью мобильных приложений для сбора данных. Создайте учетную запись в Fulcrum онлайн, используя бесплатное образовательное соглашение16. Добавьте приложение Nematode Field Sampling в учетную запись Fulcrum, нажав кнопку ADD APP17. Добавьте приложение Nematode Isolation в учетную запись, нажав кнопку ADD APP18.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы каждая поездка в место была организована как его коллекционный проект с использованием соглашения об именовании «YearMonthLocation», например, 2020FebruaryAustralia. Добавьте пользователей в учетную запись Fulcrum, чтобы предоставить им доступ к проекту коллекции. Убедитесь, что каждый пользователь загружает мобильное приложение Fulcrum для участия в проекте. Распечатайте набор этикеток с QR-кодом для отслеживания коллекций (C-меток) и изоляций нематод (S-меток) с помощью мобильного приложения. Прикрепите этикетки C к пластиковым пакетам с застежкой-молнией, сверните маркированные пакеты в группы по 25 штук и оберните их резинкой для упаковки. Храните комплект S-этикеток для использования в лаборатории.ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего этого протокола коллекции (субстраты из полевых условий) содержатся в пакетах или на пластинах и маркируются С-метками. Изолированные нематоды маркируются S-метками. C-метки используются для идентификации уникальных коллекций, а S-метки используются для идентификации уникальных изолятов нематод. Эти два типа меток используются для установления связи между определенной коллекцией (C-метка) и нематодами, изолированными от этой коллекции (S-метки) в базе данных Fulcrum. Печатайте в два раза больше S-этикеток, чем C-этикеток для проекта коллекции, потому что в среднем две нематоды изолированы в каждой коллекции. При необходимости позже можно распечатать дополнительные S-этикетки. В дополнении представлено 2 500 уникальных C-меток (Дополнительный файл 1) и 5 000 уникальных S-меток (Дополнительный файл 2). Подготовьте 10 см пластины NGMA для коллекций и 3,5 см пластины NGMA для изоляции нематод. Сделайте одну пластину размером 10 см и не менее двух пластин по 3,5 см на коллекцию21. Эти пластины засеваются штаммом Escherichia coli OP50 в соответствии с установленными протоколами. Храните пластины перед использованием при температуре 4 °C не более 1 месяца. 2. Полевой сбор ПРИМЕЧАНИЕ: Нематоды Caenorhabditis чаще всего выделяют из гниющего растительного материала, включая фрукты, орехи, семена, стручки, цветы, стебли, растительную подстилку и компост1,5,6,8. Лучшие субстраты гнилые и почти неузнаваемые как плоды или цветы; избегайте слишком сухих или влажных субстратов (рисунок 1). Субстраты наиболее эффективно собираются с поля, работая парами. Человек с бесконтактным инфракрасным термометром выберет подложку для сбора и сбора образца, в то время как его партнер использует приложение Nematode Field Sampling в Fulcrum для записи данных сбора. Пара коллекторов будет повторять этот процесс до тех пор, пока не будет собрано желаемое количество образцов. Список материалов, необходимых для полевых работ, приведен в (Дополнительная таблица 1). Откройте мобильное приложение Fulcrum, выберите в раскрывающемся меню пункт Выборка поля нематоды. Нажмите + , чтобы начать новую запись в проекте (рисунок 2A). Сфотографируйте подложку. Нажмите на поле в верхнем центре, чтобы выбрать правильный проект коллекции, выполненный на шаге 1.2 (рисунок 2B). Нажмите на поле C-label в нижней части записи коллекции и выберите Сканировать, когда появится приглашение. Отсканируйте штрих-код на сумке для сбора с помощью камеры мобильного устройства, затем нажмите «Готово» в правом верхнем углу экрана. Нажмите на поле «Подложка » и выберите тип подложки из раскрывающегося меню. Добавьте заметки о подложке, коснувшись поля «Заметки подложки» и вручную введя заметки. Выберите альбомную ориентацию в раскрывающемся меню. Выберите ландшафт, который лучше всего представляет место отбора проб. Выберите вид на небо. При выборе вида на небо опишите видимость неба на месте отбора проб (например, вид на полное небо без препятствий с деревьев или других структур = полный). Измерьте температуру поверхности подложки с помощью бесконтактного термометра и запишите значение в поле температуры подложки.ПРИМЕЧАНИЕ: Держите бесконтактный термометр не более чем на расстоянии 14 дюймов от подложки во время регистрации температуры. Измерьте температуру и влажность окружающей среды с помощью портативного устройства и запишите эти данные в соответствующие поля.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что устройство температуры и влажности окружающей среды не находится на удержании. Единица измерения изменится при отпускании кнопки. Держите устройство во внешнем кармане, чтобы избежать нерегулярных показаний. Сохраните запись в точке опоры, нажав кнопку Сохранить в левом верхнем углу экрана. Соберите около столовой ложки субстрата без палочек или других твердых кусочков, перевернув мешок для сбора, чтобы использовать его в качестве «перчатки», чтобы подобрать подложку, а затем запечатайте пакет. Положите бумажное полотенце в пакет, если образец особенно влажный.ПРИМЕЧАНИЕ: В жарком климате поместите пакеты в мягкие охладители с более прохладными пакетами, чтобы сохранить коллекции прохладными. После того, как все образцы были собраны за день, очистите оборудование для сбора, выньте батареи из зондов, перезарядите батареи, повторно заморозьте морозильные пакеты. Синхронизируйте данные коллекции Fulcrum, нажав кнопку «Синхронизировать» в левом верхнем углу приложения Nematode Field Sampling .ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка может занять несколько минут без сильного сотового соединения, поэтому может быть лучше подождать доступа к Wi-Fi. Данные останутся на мобильных устройствах и будут синхронизированы с облаком. Отправьте образцы в домашнее учреждение, поместив их в ночную коробку для доставки. Сведите к минимуму время, в течение которого образцы подвергаются воздействию температур менее 11 °C или выше 25 °C, путем отправки упаковок в дни транспортировки груза.ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство судоходных предприятий не отправляют грузы ночью в выходные дни в отдаленных местах. 3. Покрытие полевых коллекций в лаборатории ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно описывается, как организовать передачу образцов из маркированных пакетов для сбора на маркированные пластины. Образцы могут прибыть из ночной партии или непосредственно с месторождения. Получите отправление коллекций и осмотрите на наличие сломанных сумок или других доказательств повреждения. Если мешки сломаны, выбросьте материал и очистите неповрежденные мешки для сбора 70% этанолом; избегайте C-этикетки на пакете с этанолом, так как это обесцвечивает этикетку и затрудняет ее чтение. Для каждой сумки с застежкой-молнией обратите внимание на этикетку C на сумке и прикрепите соответствующую C-метку к крышке 10-сантиметровой пластины, обнаруженной бактериями OP50.ПРИМЕЧАНИЕ: Маркированные 10-сантиметровые пластины для остальной части протокола называются «С-пластинами». Самый простой способ организовать образцы – поместить мешки для сбора на лабораторный стенд с соответствующей C-пластиной сверху (рисунок 3). Для каждого сбора переложите около одной столовой ложки образца из пакета для сбора на С-пластину с помощью чистой пластиковой ложки. Добавьте образец вокруг бактериального газона в форме полумесяца или кольца, не покрывайте полностью бактериальный газон (рисунок 4).ПРИМЕЧАНИЕ: Держите столовую ложку в чистоте, помещая ее в стакан с 95% этанолом, когда она не используется. Используйте бумажное полотенце, чтобы высушить столовую ложку перед переносом дополнительных образцов. Запишите время, в течение которого коллекции были перенесены из мешков для сбора в С-пластины, и держите С-пластины при комнатной температуре (RT) в течение не менее 24 часов, прежде чем пытаться изолировать нематод в разделе 4. 4. Выделение нематод из коллекций Откройте приложение Fulcrum на мобильном устройстве и выберите Nematode Isolation в меню приложения (рисунок 5A). Создайте новую запись изоляции, коснувшись значка + в правом нижнем углу (рисунок 5B). На экране новой записи изоляции подтвердите правильный проект коллекции, проверив имя проекта, отображаемое в поле в центре верхнего края. Если отображается неправильный проект, коснитесь имени проекта, чтобы переключиться на правильный проект (рисунок 5C). Нажмите на кнопку Select под полем C-label , чтобы найти C-метку, связанную с образцом, из которого изолируются нематоды (рисунок 5D). Нажмите на значок поиска , затем нажмите на значок сканирования , чтобы отсканировать QR-код C-метки на C-пластине с камерой устройства. После сканирования QR-кода в поле C-label появится запись C-label . Нажмите на значок «Камера» в поле «Фотографии », чтобы открыть камеру устройства, и используйте его, чтобы сфотографировать образец на C-пластине с видимым QR-кодом (рисунок 5E). Нажмите «Готово», чтобы вернуться на экран изоляции.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фотографии записи изоляции могут быть использованы для изучения конкретных атрибутов подложки в более позднее время. Используйте рассекающий микроскоп для поиска нематод на С-пластине. Нажмите на поле Черви на образце , чтобы записать присутствие нематод на образце (рисунок 5F). Нажмите «Да », если нематоды присутствуют на С-пластине, и нажмите « Нет », если нематод нет. Нажимайте на треки , если присутствуют только следы нематод. Если нематод нет, парафильмируйте С-пластину и утилизируйте ее в контейнер для биологической опасности.ПРИМЕЧАНИЕ: Переверните С-пластину над мусорным баком биологической опасности и осторожно постучите по задней части пластины, чтобы выбить все отобранные субстраты. Этот шаг облегчает поиск и изоляцию нематод, которые могут находиться под подложкой на С-пластине. Если нематоды присутствуют, изолируйте до пяти нематод от С-пластины. Чтобы изолировать нематоду, перенесите одну нематоду с С-пластины на S-пластину с помощью платиновой проволочной кирки. Изолируйте здоровых, гравидных взрослых, если это возможно. Тем не менее, изолируйте другие стадии, если взрослые не найдены.ПРИМЕЧАНИЕ: После изоляции до пяти S-пластин будут иметь по одной нематоде. Держите эти S-пластины с изолированными нематодами из одной и той же C-пластины, организованными вместе в аккуратную стопку вдали от других S-пластин, пока они не будут введены в точку опоры. Нажмите на поле «Пластины с S-меткой», чтобы ввести S-пластины, используемые для этой изоляции. Нажмите на + в правом нижнем углу. Нажмите на S-метку , а затем нажмите «Сканировать », чтобы открыть камеру устройства. Используйте камеру устройства для сканирования QR-кода S-метки на S-пластине.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что код S-метки совпадает с кодом на пластине. Если он совпадает, нажмите «Готово». Если это не так, нажмите «Отмена» и повторно сканируйте, пока он не совпадет, затем нажмите «Готово». Иногда QR-коды близлежащих пластин случайно сканируются. После ввода каждой S-пластины сохраните запись с помощью кнопки Сохранить в правом верхнем углу. Запись будет утеряна, если она не будет сохранена. Нажмите на + в правом нижнем углу, чтобы добавить больше S-маркированных пластин, если это необходимо, пока не будут введены все нематоды, выделенные из C-пластины. После добавления всех пластин с S-меткой для записи изоляции нажмите кнопку < в левом верхнем углу, чтобы вернуться к экрану записи изоляции.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отменить запись изоляции, поскольку ошибки не могут быть устранены, нажмите кнопку Отмена в левом верхнем углу. На этом шаге откроется диалоговое окно с вопросом, можно ли удалить запись без сохранения. При желании нажмите Да, Отменить. Нажмите на кнопку «Сохранить» в правом верхнем углу после того, как в запись изоляции будет правильно добавлена вся информация. Затем парафильмируйте S-пластины с изолированными нематодами и откладывайте их в область, предназначенную для хранения S-пластин с нематодами. Парафильмируйте С-пластину и выбросьте ее в бункер биологической опасности. Нажмите на значок Синхронизация , чтобы загрузить все данные в Fulcrum. Отсортируйте все S-пластины в буквенно-цифровом порядке, затем поместите S-пластины в картонные коробки. Убедитесь, что S-образные пластины опущены вниз и парафильмированы. Сложите до четырех S-пластин в одну позицию в коробке и пометьте картонную коробку названием проекта, датой, временем и уникальным номером коробки. Храните маркированные коробки на RT. Эти изоляты будут проверяться на пролиферацию через 48 ч и снова через 168 ч, если это необходимо. 5. Экспорт S-пластин из Fulcrum ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно описывается, как экспортировать S-метки, используемые в процессе изоляции, из базы данных проекта Fulcrum. Эти S-метки будут использоваться для отслеживания распространяющихся изофемальных линий, пока они идентифицируются по идентичности последовательности в разделах 6-9. Войдите на веб-сайт Fulcrum и выберите приложение Nematode Isolation . Нажмите «Экспортер» в левой части экрана. Щелкните, чтобы выбрать нужный проект, и установите флажок Изоляция нематоды . Нажмите кнопку Далее , чтобы загрузить файл .zip, содержащий файл ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’. Откройте файл ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ и отсортируйте его по столбцу ‘S-label’ в порядке возрастания (самая маленькая S-метка будет сверху). Выделите все S-метки и скопируйте их из электронной таблицы. Перейдите к шаблону google sheet (wild_isolate_genotyping_template) с помощью веб-браузера19. Сделайте копию этого листа Google, щелкнув правой кнопкой мыши на вкладке Шаблон генотипирования , а затем выбрав опцию Копировать в новую электронную таблицу . Выберите Открыть электронную таблицу , чтобы просмотреть новую таблицу Google. Назовите этот новый лист именем проекта точки опоры, за которым следует «wild_isolate_genotyping», например, «2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping».ПРИМЕЧАНИЕ: Этот лист называется «листом генотипирования» во всем остальном протоколе. Вставьте S-метки, скопированные из столбца ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ ‘s_label’, в столбец листа генотипирования под названием ‘s_label’. Проверьте столбец «s_label_repeat_error» на «1». Значение ‘1’ в этом столбце означает, что S-метка дублируется где-то на листе генотипирования. При обнаружении дублирования исследуйте и исправляйте их, прежде чем двигаться дальше. Заполните столбец «isolation_box_number» листа генотипирования для всех S-меток. 6. Проверьте наличие распространения на S-пластинах Проверьте наличие размножающихся животных на S-пластинах через 48 ч после изоляции (используйте дату и время последней изоляции на коробке с шага 4.11, чтобы определить время).ПРИМЕЧАНИЕ: Размножающиеся нематоды характеризуются потомством на S-пластине. Если S-пластина распространяется, введите «1» в столбец proliferation_48 на листе генотипирования, затем переместите S-пластину в коробку с надписью «48-часовое распространение, вставка 1». Поместите максимум 88 S-пластин в ящик для распространения, затем начните заполнять новую коробку с надписью «48-часовое распространение, коробка 2». Убедитесь, что S-метки организованы в буквенно-цифровом порядке в 48-часовых ящиках распространения.ПРИМЕЧАНИЕ: Не утилизируйте нераспространяющиеся S-пластины; эти пластины будут проверены снова через 168 часов после изоляции. При желании консолидируйте эти S-пластины в числовом порядке в полях с надписью «48 ч нераспространения, коробка X», но не забудьте записать, когда на новом поле должна произойти отметка 168 ч. После идентификации всех распространяющихся S-меток через 48 ч перейдите к разделу 7 для S-пластин с пролиферацией через 48 ч. Проверьте S-пластины, которые не размножались через 48 ч после изоляции, снова через 168 ч после изоляции. Если S-пластина в настоящее время распространяется, введите «1» в столбец proliferation_168 на листе генотипирования, а затем переместите S-пластину в коробку с надписью «168-часовое распространение, вставка 1». Поместите максимум 88 S-пластин в ящик для распространения, а затем начните заполнять новую коробку с надписью «168 ч распространения, коробка 2». Обязательно организуйте S-метки в буквенно-цифровом порядке в коробках распространения 168 ч. Выбросьте S-пластины, которые не имеют распространения через 168 ч. Переходим к разделу 7 для S-пластин с разрастанием через 168 ч. 7. Лизис изофемальных линий ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге будет использоваться инструмент фильтрации данных в листах Google, чтобы помочь распечатать листы лизиса для S-пластин в полях распространения. Целью листов лизиса является предоставление персоналу правильных положений для S-меток в лизисных ленточных трубках на стенде. Откройте лист генотипирования для нужного проекта и выделите все ячейки, введя Cmd+A. Щелкните Data > Создать фильтр, чтобы добавить кнопку фильтра в заголовок каждого столбца. Используйте кнопки Фильтр для отображения только S-пластин, которые будут генотипизированы. Например, если все S-пластины с разрастанием через 48 ч должны быть лизированы: нажмите кнопку «Фильтр» в столбце «proliferation_48» и выберите «1». После того, как лист Google генотипирования был отфильтрован, просмотрите список отображаемых S-меток, чтобы убедиться, что они являются S-метками, которые будут напечатаны на листе. В столбце «strip_tube_number» листа Google для генотипирования введите уникальный номер каждые 11 строк. Введите номера трубок полосы для проекта в последовательном порядке, начиная с 1 и никогда не дублируя. В поле «strip_tube_position» введите от 2 до 12 для каждого номера трубки полосы.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 12-трубные ленточные трубки для лизиса. Первой позицией (strip_tube_position 1) будет контроль, но элементы управления не добавляются на листы лизиса (добавляются только strip_tube_positions, 2-12). Во время лизиса положительный контрольный штамм ‘N2’ будет добавлен в положение 1 каждой четной ленточной трубки в качестве положительного контроля. Никакие черви не добавляются в положение 1 каждой трубки с нечетной полосой в качестве отрицательного контроля. Отфильтруйте лист Google для генотипирования, чтобы включить только S-метки в один ящик для распространения, которые должны быть лизированы, затем выберите столбцы «s_label» через «lysis_notes». Распечатайте лист лизиса для каждой коробки распространения, подлежащей лизированию. Нажмите на раскрывающееся меню в поле Печать и выберите Выбранные ячейки. Нажмите «Далее » в правом верхнем углу, затем используйте диалоговое окно, чтобы распечатать лист лизиса для поля распространения. Повторите шаги 7.3-7.5, чтобы напечатать лист лизиса для каждой коробки распространения.ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый ящик для пролиферации вмещает до 88 S-пластин, что соответствует восьми 12-луночным ленточным трубам. Подготовьте 12-луночные ленточные трубки для всех образцов, которые будут лизироваться. Пометьте ленточную трубку уникальным «strip_tube_number», назначенным на листе лизиса. Эта этикетка должна быть написана на полоске колпачка и ленточной трубке, чтобы избежать путаницы, если они разделены. Трубы с полосой EVEN имеют положительный контроль (черви N2) в положении 1. Трубы с полосой ODD имеют отрицательный контроль (без червей) в положении 1. Внесите достаточный буфер лизиса (100 мМ KCl, 20 мМ Tris pH 8,2, 5 мМ MgCl2, 0,9% IGEPAL, 0,9% Tween 20, 0,02% желатина с добавлением протеиназы K к конечной концентрации 0,4 мг/мл) для всех образцов и добавьте 5% дополнительно для погрешности пипетки. Масштабируйте по мере необходимости.ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лизиса лучше всего готовить путем объединения всех ингредиентов, кроме протеиназы К и замораживания в 10-50 мл аликвот при -20 °C. Разморозить аликвоты и держать при температуре 4 °C перед использованием; непосредственно перед употреблением добавляют протеиназу К и тщательно перемешивают. Держите буфер лизиса на льду во время работы. Расположите S-пластины для конкретной ленточной трубки по порядку, используя печатный лист лизиса в качестве руководства. Снимите крышку с одной ленточной трубки и добавьте 8 мкл буфера лизиса к каждому колпачку с помощью повторного пипетка. Добавьте буфер лизиса в одну полоску колпачков за раз, потому что буфер лизиса испарится, если его оставить в RT и открыть. Выберите 3-5 животных из исходных пластин (S-образная пластина или N2 для положительного контроля) в соответствующие положения крышки, указанные на листе лизиса. Запишите заметки для любой S-пластины с менее чем 5 червями, отобранными для лизиса, в lysis_notes разделе рабочего листа лизиса. После загрузки нематод в каждое положение ленточной трубки поместите полоску колпачка обратно на ленточную трубку. Сопоставьте отмеченный колпачок (позиция 1) с маркированной трубкой (позиция 1). После закрытия центрифугируйте ленточную трубку ненадолго, пока нематоды не окажутся в нижней части трубки. Поместите полоску в морозильную камеру при температуре -80 °C до полного замораживания (не менее 10 мин). Повторяйте шаги с 7.9 по 7.11 до тех пор, пока во все полоски не будут добавлены нематоды для лизиса. Организуйте полоски трубок в числовом порядке. Снимите наборы ленточных трубок и запустите программу лизиса в термоциклере: 1 ч при 60 °C, 15 мин при 95 °C, держите при 12 °C. Когда программа лизиса завершена, раскрутите образцы при 300 x g в течение 15 с на RT и храните лизаты при -80 °C в течение 1 недели. Организуйте полосы трубок в числовом порядке с помощью держателей пластин с 96 скважинами и включите этикетку с номером коробки распространения, диапазоном номеров трубок полосы, датой и инициалами исследователя. Обновите столбцы листа генотипирования «lysis_date» и «lysis_notes» информацией из листа лизиса. 8. ПЦР последовательностей SSU и ITS2 ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе содержатся инструкции о том, как выполнить две отдельные ПЦР для каждой лизированной S-пластины. Первый набор праймеров усиливает 500-bp фрагмент 18S рДНК малого субъединичного гена (SSU); oECA1271 = прямая грунтовка TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = обратная грунтовка CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA 12. Эта ПЦР используется для проверки качества шаблонной ДНК. ПЦР усиливает область SSU почти для всех видов нематод. Если ПЦР СГУ не может усилиться, этот результат говорит о том, что качество лизиса плохое и лизис должен быть повторен для этой S-пластины. Второй набор праймеров усиливает 2000-битный фрагмент внутренней транскрибированной спейсерной области между генами рДНК 5,8S и 28S (ITS2); oECA1687 = прямая грунтовка CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = обратная грунтовка GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3. Продукт ПЦР ITS2 секвенирован Сэнгером, и последовательность используется для идентификации нематод рода Caenorhabditis до видового уровня по сходству последовательностей. Используйте инструмент фильтрации на листе генотипирования, чтобы просмотреть только S-метки, которые будут использоваться для ПЦР. Обновите pcr_plate_number и pcr_well столбцы на листе генотипирования. Для предотвращения деградации лизизного материала одновременно проводятся ПКР SSU и ITS2. Используйте один и тот же pcr_plate_number для ПЦР ITS2 и SSU, даже если это отдельные реакции в отдельных пластинах. Они будут различаться маркировкой «SSU» или «ITS2». Назначают pcr_plate_number до восьми или менее ленточных трубок (по одной ленточной трубке на ряд 96-луночной ПЦР-пластины, расположенной в порядке возрастания, например, с наименьшим номером трубки полосы сверху). Затем назначьте pcr_plate_well на каждую S-метку в ленточных тубах.ПРИМЕЧАНИЕ: Ленточные трубы расположены в порядке возрастания, причем наименьший номер трубы полосы присваивается строке A, а наибольший номер – строке H. Позиция 1 всех ленточных труб назначена колонке 1. Поэтому ленточной трубке No1, позиция 1 будет присвоена ПЦР-пластине No1, колодец А01. Маркировка 96-луночной ПЦР-пластины (пластин) для размещения образцов, которые будут использоваться для ПЦР. Пометьте каждую пластину ПЦР следующей информацией: название проекта, тип ПЦР, номер пластины ПЦР и дату ПЦР (например, 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Кроме того, пометьте пластину номерами трубок, которые будут загружены в каждый ряд. Извлеките материал лизиса из морозильной камеры при температуре -80 °C и разморозьте ленточные трубки, содержащие материал лизиса, на льду. Пока материал лизиса оттаивает, приготовьте мастер-миксы ITS2 и SSU в отдельных трубках на льду. Рецепты ПЦР SSU и ITS2 приведены в дополнительной таблице 2.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте 100 реакций мастер-смеси ПЦР для каждой 96-луночной пластины, чтобы учесть ошибку пипетирования. Используйте коническую смесь объемом 15 мл или 50 мл для удержания основной смеси, если необходимо использовать большие объемы. Осторожно вращайте мастер-микс до тех пор, пока Taq не будет распределен по всему миксу. После смешивания аликвота 38 мкл мастер-смеси в соответствующие лунки ПЦР-пластин на льду. Используйте стерильные одноразовые v-образные желоба и 12-луночную многоканальную пипетку для переноса основной смеси на пластины ПЦР. Открутите размороженные лизисные ленточные трубки, чтобы удалить материал лизиса из колпачков. Осторожно снимите крышки всех ленточных трубок, которые будут загружены в первую ПЦР-пластину. Используйте малообъемную многоканальную пипетку (либо 12-луночную, либо 8-луночную), чтобы добавить 2 мкл лизата в соответствующую скважину в пластине ПЦР. Аккуратно выпейте лизат вверх и вниз один раз, прежде чем удалить 2 мкл.ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте советы, чтобы убедиться, что они содержат лизис перед переносом. Не забудьте изменить подсказки между строками или столбцами. Накройте пластину ПЦР клейкой фольгой ПЦР и используйте ролик для создания плотного уплотнения. После нанесения фольги кратковременно раскрутите пластины ПЦР в центрифуге. Держите пластину на льду до тех пор, пока она не будет готова к работе в термоциклере. Запустите PCR с соответствующей программой термоциклера. Подробную информацию о программах ПЦР SSU и ITS2 см. в Дополнительной таблице 2 . Повторяйте шаги 8.4-8.8 до тех пор, пока не будут запущены все PCR. Пока идут реакции ПЦР, влейте 100 мл 1,5% агарозного геля. Каждый гель будет содержать образцы или одну пластину ПЦР. Добавьте 1,5 г агарозы в колбу объемом 500 мл, затем добавьте 100 мл 1x буфера TAE (дополнительная таблица 3) и закрутите для смешивания. Микроволновая печь для растворения и охлаждения геля. Как только раствор остынет, добавьте 5 мкл 10 мг/мл раствора бромида этидия и перемешайте до однородной массы. Вылейте раствор в литейный лоток с четырьмя 25-луночными гребнями, чтобы гель мог вместить 96 образцов плюс лестницу для каждого ряда в геле.ПРИМЕЧАНИЕ: Бромид этидия является мощным мутагеном. При обращении с бромидом этидия используйте лабораторный халат, химически стойкие перчатки и очки химической безопасности. Непосредственно перед завершением ПЦР добавьте 6-кратный загрузочный краситель в одноразовый желоб и используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 2 мкл 6-кратного загрузочного красителя в каждую скважину новой 96-луночной ПЦР-пластины. Эта пластина будет использоваться для загрузки образцов в гель. Сделайте достаточно этих пластин, чтобы вместить все образцы. Когда ПЦР сделаны, удалите пластины ПЦР и кратковременно центрифугируйте их при 300 х г в течение 15 с на RT. Храните пластины ПЦР на льду, пока продукты ПЦР не будут исчерпаны на геле. Чтобы запустить продукты на геле, используйте 12-луночную многоканальную пипетку, чтобы добавить 5 мкл каждого образца в соответствующий колодец 96-луночной пластины, содержащей 2 мкл 6-кратного загрузочного красителя. Затем загрузите 6 мкл этой смеси в каждую лунку недавно отлитого геля. Загрузите 6 мкл по 1 КБ плюс лестница в первый колодец каждого ряда геля.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы заполнить лунки гелем, может потребоваться вставить ряд А и ряд В из пластины ПЦР в первый ряд геля. Чтобы избежать путаницы, запишите gel_number и gel_position в лист генотипирования для каждого образца ПЦР. Поместите новую фольгированную крышку на оставшуюся ПЦР в пластине (пластинах) и храните их при 4 °C. Эти реакционные продукты будут использоваться для секвенирования на этапе 9. Запустите продукты ПЦР на гель при 120 В в течение 20 мин. Визуализируйте гель и запишите, какие S-метки дают продукты ITS2 и/или SSU PCR в столбцах «pcr_product_its2» и «prc_product_ssu» листа генотипирования. Отметьте наличие группы с помощью ‘1’; отметьте ‘0’ для группы без группы. 9. Идентификация нематод с помощью секвенирования И последовательности BLAST Сэнгера ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе приведены инструкции по секвенированию ампликонов ITS2 из S-меток, выравниванию этих последовательностей с базой данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с использованием алгоритма BLAST и анализу результатов BLAST для идентификации нематод на S-пластинах. Для каждого образца, который является ITS2-положительным, используйте оставшийся продукт ITS2 PCR для секвенирования Сэнгера с использованием прямой праймера oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Организуйте, чтобы выходные файлы секвенирования были легко связаны с S-меткой, записав столбцы «sequencing_plate» и «sequencing_well» каждой S-метки в листе генотипирования. Получите выходные файлы .seq для каждой S-метки с платформы виртуализации. Расположите SEQ-файлы для проекта в одном каталоге с SEQ-файлами для каждого пакета виртуализации, расположенными в подкаталогах. Откройте средство интерфейса командной строки и перейдите в верхний каталог, содержащий SEQ-файлы, введя команду: cd . Если он еще не существует, создайте объединенную FASTA для всех файлов .seq, введя следующую команду: для dir в */; do cd $dir; для файла в *.seq; do echo “>”$file; cat $file; done >>.. /all_seqs.фа; кд..; сделано.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот код создаст объединенный файл FASTA с именем ‘all_seqs.fa’ из всех файлов .seq в каталоге проекта. Этот файл может быть использован в онлайн-инструменте NCBI для быстрого выравнивания последовательности ITS2 каждой S-метки по базе данных последовательностей NCBI. В веб-браузере перейдите на веб-сайт NBCI BLAST20 и нажмите кнопку Выбрать файл . Выберите только что созданный файл all_seqs.fa, затем нажмите кнопку Несколько похожих последовательностей (BLASTn).. Нажмите кнопку BLAST в нижней части страницы, чтобы начать поиск BLAST. Обновите лист генотипирования результатами BLAST для каждой S-метки. Используйте инструмент фильтра, чтобы упростить обновление листа Google для генотипирования. Щелкните Данные > Создать фильтр , чтобы добавить кнопку фильтра в заголовок каждого столбца. Отфильтруйте столбец sequencing_plate, чтобы выбрать пластины последовательности, которые должны быть обновлены с помощью результатов BLAST. Используйте раскрывающееся меню на странице результатов NCBI BLAST, чтобы проверить результаты для каждой последовательности ITS2 S-пластины (рисунок 6). Проверьте, нет ли попаданий BLAST. Идентификатор последовательности в раскрывающемся списке с префиксом * не имеет поражений взрыва. Для этих S-меток введите «no hit » в столбце manual_blast_notes листа генотипирования. Проверьте возможный новый вид Caenorhabditis . Нажмите на ссылку в верхней части хита, чтобы визуализировать выравнивание (рисунок 6). Если верхним попаданием является (1) вид Caenorhabditis , (2) выравнивание содержит более пяти несоответствий в центре последовательности, и (3) охват запросов превышает 50%, этот результат предполагает, что изолят может быть новым видом Caenorhabditis (рисунок 7). Для этих S-пластин входят виды верхнего BLAST, попавшего в столбец «species_id», введите 1 в столбце «possible_new_caeno_sp» и «возможный новый Caeno sp.» в столбец «manual_blast_notes» вместе с процентной идентичностью (например, «возможная новая идентичность Caeno sp. 89%). Для последовательностей S-пластин, которые ВЗРЫВАЮТся к виду Caenorhabditis , введите полный род и название вида верхнего хита BLAST в столбце «species_id». Например, «Caenorhabditis elegans». Для последовательностей S-пластин, которые ВЗРЫВАЮТся к виду, не относящемуся к Caenorhabditis , введите только род верхнего удара BLAST, за которым следует «sp» в столбце «species_id». Эта нотация означает, что изолят является неизвестным видом в пределах названного рода. Например, ‘Oscheius sp.’.ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность ITS2 не может быть использована для надежной идентификации изолятов до видового уровня за пределами рода Caenorhabditis3,13. Введите 1 в столбец «make_strain_name» листа генотипирования, если «species_id» = «Caenorhabditis elegans», «Caenorhabditis briggsae» или «Caenorhabditis tropicalis», ИЛИ «possible_new_caeno_sp» = 1. Назовите штаммы уникальными названиями в соответствии с номенклатурными соглашениями Caenorhabditis , то есть уникальным лабораторным обозначением, состоящим из 2-3 прописных букв, за которыми следует число для каждого уникального штамма23. Введите имена штаммов в столбец ‘strain_name’. После того, как штаммы названы, они могут быть криоконсервированы с использованием установленных протоколов 24. 10. Обработка данных коллекции с помощью пакета easyFulcrum в R ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге описывается, как связать данные сбора (C-метки) и данные изоляции нематод (S-метки) вместе с помощью пакета easyFulcrum R. Программное обеспечение содержит функции, которые будут далее объединять данные Fulcrum с данными генотипирования из листа генотипирования, так что идентификаторы видов S-меток и названия штаммов организованы в единый фрейм данных. Создайте новый каталог с именем для проекта коллекции. Расположите структуру папок в каталоге в соответствии с требованиями, описанными в пакете R easyFulcrum15. Перейдите на веб-сайт Fulcrum и войдите в систему. Экспортируйте необработанные данные проекта из базы данных Fulcrum с помощью инструмента экспорта данных веб-сайта Fulcrum слева и установите следующие флажки: проект, включить фотографии, включить данные GPS, выборку полей и изоляцию.ПРИМЕЧАНИЕ: Данные Fulcrum для проекта будут экспортированы в виде пяти файлов с разделителями-запятыми (.csv). Полные данные проекта будут объединены в единый фрейм данных с помощью пакета easyFulcrum в R. Переместите пять .csv файлов, экспортированных из Fulcrum, в каталог проекта, созданный на шаге 10.1, как указано в vignette easyFulcrum21. Откройте сеанс Rstudio и установите пакет easyfulcrum в R, введя следующие команды в консоли R ‘install.packages(“devtools”)’ и ‘devtools::install_github(“AndersenLab/easyfulcrum”)’. Откройте новый сценарий R и следуйте инструкциям в виньетке easyfulcrum для обработки данных коллекции21.