O presente protocolo fornece descrições detalhadas para isolamento, concentração e caracterização de vesículas extracelulares de culturas cianobacterianas. Abordagens para purificar vesículas de culturas em diferentes escalas, trocas entre metodologias e considerações para o trabalho com amostras de campo também são discutidas.
As cianobactérias são um grupo diversificado de bactérias fotossintéticas gram-negativas que desempenham papéis críticos nos ecossistemas globais e servem como modelos essenciais de biotecnologia. Trabalhos recentes demonstraram que tanto as cianobactérias marinhas quanto as de água doce produzem vesículas extracelulares – pequenas estruturas ligadas à membrana liberadas da superfície externa dos micróbios. Embora as vesículas provavelmente contribuam para diversos processos biológicos, seus papéis funcionais específicos na biologia cianobacteriana permanecem amplamente desconhecidos. Para incentivar e avançar a pesquisa nesta área, é apresentado um protocolo detalhado para isolar, concentrar e purificar vesículas extracelulares cianobacterianas. O trabalho atual discute metodologias que isolaram com sucesso vesículas de grandes culturas de Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis. São apresentados métodos para quantificar e caracterizar amostras de vesículas dessas cepas. Abordagens para isolar vesículas de amostras de campo aquático também são descritas. Finalmente, desafios típicos encontrados com a purificação da vesícula cianobacteriana, considerações metodológicas para diferentes aplicações a jusante e as trocas entre abordagens também são discutidas.
Vesículas extracelulares (EVs) são estruturas esféricas, variando entre ~20-400 nm de diâmetro, liberadas por praticamente todos os organismos em seu ambiente circundante 1,2,3. Vesículas são delimitadas por um bicamado lipída e não podem se replicar. Em bactérias gram-negativas, acredita-se que essas estruturas surgem principalmente por “blebbing” de pequenas porções da membrana externa. Ainda assim, outros processos, incluindo movimento flagelar, lise celular e secreção de material de membrana interna e externa, podem produzir vesículas, bem como 4,5. Os EVs podem conter várias biomoléculas, incluindo lipídios, proteínas solúveis e membranas, ácidos nucleicos e metabólitos, e podem transportar esse material entre as células 4,5,6. Diante dessas características, os EVs estão sendo estudados para entender seus possíveis papéis em uma ampla gama de processos biológicos, incluindo comunicação celular, formação de biofilmes, transferência horizontal de genes, dinâmica de host-phage e troca de nutrientes 4,6.
As cianobactérias são um grande e diversificado grupo de bactérias Gram-negativas, incluindo organismos unicelulares e filamentosos. Eles são de interesse de muitas perspectivas, incluindo a compreensão de sua fisiologia e diversidade 7,8, as funções críticas do ecossistema que eles atendem 9,10, e sua utilidade para a biotecnologia 11,12. As cianobactérias são encontradas em uma grande variedade de habitats, seja como organismos livres em ambientes marinhos, de água doce e terrestre, ou em associações simbióticas com musgos, samambaias, plantas ou em líquens e esponjas13. Eles servem como produtores primários cruciais em ecossistemas aquáticos, produzindo oxigênio e carbono orgânico através da fotossínteseoxigena 9,10, e alguns são capazes de fixar nitrogênio atmosférico também 7. Cianobactérias marinhas e de água doce, incluindo Prochlorococcus, Synechococcus e Synechocystis, produzem EVs em condições laboratoriais 14,15,16, e vesículas cianobacterianas também podem ser encontradas em ambientes naturais 14,17. As funções biológicas e ecológicas das vesículas cianobacterianas são desconhecidas, mas novas pesquisas nessa área provavelmente fornecerão novas percepções sobre questões sobre fisiologia cianobacteriana, diferenciação, estratégias de comunicação, evolução e interações tróficas. Além disso, a capacidade dos EVs cianobacterianos de transportar diversas categorias de biomoléculas pode ter aplicações comerciais18,19.
O presente protocolo descreve métodos para isolar e caracterizar vesículas de culturas cianobacterianas e amostras de campo para permitir e incentivar um exame mais amplo da biologia vesícula extracelular cianobacteriana. Embora o fluxo de trabalho descrito aqui seja análogo a protocolos de isolação e caracterização de EVs de outras bactérias, culturas cianobacterianas e amostras de campo normalmente contêm concentrações de células e vesículas mais baixas do que são comumente observadas com sistemas de modelos associados ao hospedeiro oupatogênicos 20,21,22. Assim, estudos de EVs cianobacterianos exigem considerações e otimizações especiais para cultivo e isolamento vesícula, que variam ainda mais entre cepas e origens midiáticas. Como nenhum protocolo único funcionará igualmente bem para todas as cepas, condições de crescimento e aplicações a jusante, fornecemos múltiplas opções e discutimos as compensações envolvidas para que os pesquisadores possam determinar as abordagens mais apropriadas para abordar suas questões experimentais.
Considerações gerais
O protocolo (Figura 1) é apresentado como um conjunto de opções para destacar que não existe um método “de tamanho único” para trabalhar com vesículas extracelulares cianobacterianas. Os pesquisadores interessados podem utilizar as seções deste protocolo compatíveis e apropriadas para seu organismo modelo específico, perguntas/objetivos experimentais e disponibilidade de equipamentos. Todas as abordagens de isolamento vesícula envolvem trocas e inevitavelmente resultarão em algum grau de viés. Embora se deva procurar minimizar isso sempre que possível, a consideração mais crucial é garantir que a metodologia detalhada utilizada seja relatada de acordo com as diretrizes36 do MISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles).
Crescimento da cultura
Culturas cianobacterianas podem ser prontamente obtidas de uma das muitas coleções culturais disponíveis em todo o mundo. Alguns exemplos são a Coleção de Cultura Roscoff (Station Biologique de Roscoff, França), a Coleção de Cultura Pasteur (Institute Pasteur, Paris, França) e o Centro Nacional de Algas Marinhas e Microbiota (NCMA, Maine, EUA). A cepa cianobacteriana de escolha deve ser cultivada nas condições médias e ambientais adequadas, variando significativamente entre diferentes cepas. Uma lista de mídias comumente usadas para cultivo cianobacteriano pode ser encontrada em sites de coleta de cultura ou outras publicações 37,38,39.
Trabalhar com vesículas extracelulares cianobacterianas apresenta alguns desafios únicos em comparação com as metodologias relatadas para muitos heterotrófos típicos de laboratório. As culturas cianobacterianas têm concentrações vesículas de ordens de magnitude inferiores às encontradas em outros micróbios, como escherichia coli 14,16,40. Essas diferenças, presumivelmente decorrentes de densidades celulares mais baixas e/ou taxas de produção de vesículas, significam que culturas relativamente grandes (~1-20 L ou mais) podem ser necessárias para produzir material suficiente para análises em massa. Assim, os pesquisadores são encorajados a testar os rendimentos de vesículas de culturas de menor escala para determinar quanto material será necessário para atingir seus objetivos finais desejados. A importância de estabelecer se a mídia utilizada para o experimento tem um fundo particulado detectável também precisa ser enfatizada antes de iniciar qualquer experimento, pois esse material pode potencialmente confundir a quantificação populacional de vesículas, reduzir a sensibilidade das medidas de concentração/tamanho vesículas ou contaminar as preparações finais da vesícula.
Outro desafio para o campo é que nem todas as cianobactérias crescem bem, ou em tudo, na cultura pura. Até que seja feita axenic, interpretações de características físicas de vesícula, taxas de produção ou conteúdo não podem necessariamente levar a conclusões claras sobre vesículas produzidas por qualquer cepa na comunidade. Os pesquisadores também são aconselhados a considerar quais outros tipos de partículas poderiam estar presentes e potencialmente confundidas com vesículas por ferramentas específicas de análise de nanopartículas, que não podem necessariamente discriminar entre diferentes tipos de partículas. Por exemplo, pode ser essencial verificar se a cepa que está sendo utilizada não possui uma prophagem, seja através de sequenciamento de genoma, ensaios de indução ou outros meios ou não libera outros tipos de material particulado. Em nossa experiência, a maioria das vesículas cianobacterianas têm <0,2 μm de diâmetro, mas quando se olha para uma nova cepa ou condição de crescimento, deve-se confirmar se o uso de um filtro de tamanho de poros de 0,45 μm altera a distribuição de tamanho de partículas purificadas.
Muitos aspectos das condições culturais podem influenciar a produção de vesículas e seu conteúdo41,42. Assim, as condições físicas e químicas utilizadas para o crescimento da cultura (incluindo irradiação leve, temperatura e composição de mídia) precisam ser documentadas e controladas na medida do possível para garantir a reprodutibilidade dos resultados. Qualquer análise química do conteúdo vesícula deve ser responsável pela composição de fundo, particularmente na realização de análises de alto rendimento ao estilo “omics”. Isso pode ser especialmente crítico ao usar mídia indefinida, como aquelas baseadas em um fundo natural de água do mar ou complementadas com extrato de levedura ou triptona. O uso de um meio de crescimento definido pode ser preferível dependendo das metas experimentais.
Os pesquisadores precisam monitorar cuidadosamente a dinâmica de crescimento da cultura em intervalos regulares para garantir que eles saibam onde na fase de crescimento está uma determinada cultura de lote e não apenas coletar amostras após um período arbitrário de tempo. A composição vesícula pode variar entre as fases de crescimento, particularmente entre fases exponenciais e estacionárias41,42. Por exemplo, pelo menos uma fração de vesículas amostradas na fase estacionária pode surgir de um mecanismo celular diferente, como a lise celular, que não ocorrerá durante o crescimento exponencial. Embora isso ainda possa ser de grande interesse biológico, é essencial conhecer a amostra. Se uma cultura cianobacteriana atingir a fase de crescimento desejada em um momento em que não é possível proceder diretamente à concentração amostral, é recomendado o armazenamento das células da fração de <0,2 μm imediatamente (com centrifugação e/ou filtragem direta de 0,2 μm), e, em seguida, é recomendado armazenar o filtrado livre de células a 4 °C. O material pode ser armazenado desta forma por dias com pouco ou nenhum impacto perceptível na concentração ou distribuição de tamanho das vesículas.
Purificações vesículas
A necessidade frequente de isolar vesículas de culturas de volume significativo é vital no fluxo de trabalho de isolamento de vesículas cianobacterianas. Ao trabalhar com volumes maiores de material, as vesículas precisarão ser concentradas antes dos fluxos de trabalho de separação a jusante. Concentradores (membranas de filtro de fluxo tangencial ou colunas centrífugas) com um limite nominal de peso molecular de 100 kDa são geralmente aconselhados, pois permitem a separação de material solúvel com baixo peso molecular, mantendo os tempos de concentração razoáveis, mas os filtros de 30 kDa também são frequentemente usados com sucesso. Enquanto vários métodos não-ultracentrifugadores de purificação de vesículas (por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho, sistemas baseados em microfluidic, técnicas de captura de afinidade e abordagens baseadas em precipitação) estão se tornando populares no campo vesícula extracelular, em nossa experiência, essas abordagens podem resultar em rendimentos reduzidos e são tipicamente incompatíveis com os volumes de cultura necessários.
Os pesquisadores precisam considerar a composição do fundo iodixanol e os buffers de lavagem/ressuspensão usados durante a purificação vesícula para garantir que sejam compatíveis com as aplicações a jusante desejadas. Em muitos casos, a amostra final de vesícula pode ser resuspendida em mídia de crescimento ou um buffer definido comparável na composição ao meio de crescimento (por exemplo, natural versus água do mar artificial). No entanto, isso pode não ser possível com vesículas cianobacterianas marinhas, o que exigirá mais manipulação experimental para análise, já que altas concentrações de sal semelhantes aos níveis de água do mar podem inibir muitas reações enzimáticas. Nesses casos, tampões de laboratório padrão como 0,2 μm filtrado, 1x PBS normalmente funcionam bem para manter a estabilidade das vesículas cianobacterianas marinhas e podem ser mais compatíveis com processos experimentais a jusante.
A purificação do gradiente de densidade pode ser considerada opcional dependendo das metas experimentais e da composição da cultura, mas é fortemente recomendada para produzir uma amostra mais rigorosamente pura e reprodutível. As populações de EV são heterogêneas e podem ser encontradas em uma variedade de densidades flutuantes, que variam ainda mais de tensão, condições de crescimento e outros fatores 4,5,6. As densidades listadas acima representam aquelas tipicamente encontradas para vesículas de culturas cianobacterianas e amostras de campo em iodixanol, mas os resultados em outras cepas podem variar. Outros materiais gradientes de densidade, como sacarose e CsCl, podem ser utilizados para vesículas, mas migrarão para diferentes densidades flutuantes nesses fundos. Diferentes fundos de mídia gradiente podem viés de recuperação de vírus lipídios43 e podem potencialmente influenciar a recuperação de vesículas de diferentes cepas.
Vesículas podem ser perdidas em vários pontos através do isolamento vesícula, e processo de purificação gradiente descrito aqui, reduzindo os rendimentos e aumentando a quantidade de material inicial necessário para alcançar um determinado rendimento final de vesícula para aplicações a jusante. Deve-se tomar cuidado especial ao trabalhar com pelotas de vesícula após a ultracentrifugação. Embora algumas vesículas cianobacterianas possam ter carotenoides ou outros compostos que possam emprestar às amostras de vesícula alguma quantidade de pigmentação (Figura 2), dependendo da cepa ou quantidade de material, não é necessariamente esperado que seja capaz de visualizar a pelota de vesículas diretamente. Esteja ciente de onde a pelota deve ser dada o tipo de rotor centrífuga usado. Quando possível, as amostras de vesículas purificadas são sugeridas a serem examinadas por microscopia eletrônica para verificar a composição do material final recuperado.
O impacto das condições de armazenamento nas vesículas e seu conteúdo continua sendo uma questão em aberto. Embora se descobriu que o armazenamento não tem um efeito notável sobre o tamanho ou concentração de vesícula cianobacteriana14, a funcionalidade de preparações isoladas de vesículas pode mudar com o tempo44. Embora os ciclos de congelamento/degelo devem ser evitados sempre que possível, o impacto do congelamento de amostras nos números e tamanhos globais de vesículas parece ser mínimo. Deve-se estar ciente do potencial de ciclos de congelamento para influenciar a composição do conteúdo vesícula, como o comprimento dos ácidos nucleicos associados à vesícula ou a estabilidade das proteínas.
Vesículas de field samples
Os métodos atuais para isolar vesículas extracelulares de ambientes aquáticos naturais são conceitual e operacionalmente semelhantes aos descritos aqui para culturas de grande volume. Ainda assim, eles podem exigir volumes ainda maiores de material. Essas amostras de campo podem envolver coleta, filtração e concentração de centenas a milhares de litros de água para obter material suficiente para análise. Dependendo da turbidez da amostra utilizada, pode ser necessária a incorporação de um ou mais passos de pré-filtragem antes do filtro de 0,2 μm. O dispositivo TFF específico utilizado deve ser apropriado para trabalhar com volumes tão grandes em uma quantidade razoável de tempo (idealmente na ordem das horas) e sem colocar pressão excessiva sobre a amostra. Na prática, isso muitas vezes envolve o uso de uma área de superfície total muito maior do que poderia ser aplicada a amostras baseadas em cultura, bem como tubos de maior diâmetro para facilitar o aumento das taxas de fluxo. Esse aumento da área da superfície do filtro provavelmente levará a um aumento marginal nas perdas de partículas em comparação com arranjos menores de TFF e um maior volume final de concentrado; no entanto, essas preocupações devem ser equilibradas com considerações do tempo total de processamento. Para situações como um cruzeiro oceanográfico estendido onde as amostras não retornarão a um laboratório por muitos dias após a amostragem, recomendamos a realização de filtragem inicial de 0,2 μm e etapas de TFF no campo. Este volume menor de material concentrado pode então ser armazenado a 4 °C ou -80 °C a bordo (dependendo da disponibilidade e considerações analíticas a jusante) até que seja devolvido ao laboratório para processamento final.
O isolamento e a separação de vesículas extracelulares de outras partículas pequenas, tanto orgânicas quanto inorgânicas, podem ser desafiadores, e os métodos para separar diferentes partículas ainda não são perfeitos. Por exemplo, gradientes de densidade iodixanol podem não separar prontamente todas as classes de vesículas e vírus presentes em uma determinada amostra. Como os tipos de partículas de confusão, e suas propriedades físicas, variam entre os locais de amostragem, atualmente é impossível fornecer um protocolo que irá dividir robustamente todas as classes de pequenas partículas aquáticas. Tentativa e erro são essenciais, e a experimentação com a faixa iodixanol usada nas condições de gradiente e ultracentrifugação será necessária para maximizar a separação; uma coleção de menores volumes, frações de densidade mais finamente resolvidas também podem ser necessárias. Dependendo do contexto, o uso de gradientes de CsCl em vez de iodixanol pode ajudar a separar partículas ambientais45. Ainda assim, a mudança nas condições osmóticas pode levar a vieses nos produtos recuperados finais, como discutido acima.
Caracterização vesícula
Os instrumentos de análise de nanopartículas ainda não estão disponíveis rotineiramente em ambientes laboratoriais de microbiologia, mas estão se tornando cada vez mais disponíveis. Todas as metodologias têm prós e contras, e não fazemos nenhum endosso específico de uma plataforma como sendo melhor do que todas as outras para o trabalho de vesícula cianobacteriana; na verdade, todos têm compensações particulares em relação a custos, resolução, facilidade de uso, limites de detecção, compatibilidade com diferentes fundos de mídia/buffer de crescimento e reprodutibilidade de dados. Além de instrumentos baseados na análise de rastreamento de nanopartículas descritas acima, outras abordagens, incluindo citometria de nanofluxo, sensoriamento de pulso resistivo microfluido e sensoriamento de pulso resistivo, podem ser aplicadas46,47. Os usuários devem ter cuidado para saber os detalhes de sua instrumentação disponível e verificar se ele funciona bem com seu sistema, pois encontramos dificuldades ao usar algumas plataformas com mídia baseada em água do mar. Incentivamos o campo a avançar em direção à caracterização quantitativa do tamanho da vesícula, concentrações e taxas de produção. Medir as concentrações de vesículas em uma base fundamental de partículas per mL, e não em termos de conteúdo proteico ou outras métricas, permitirá a integração das vesículas em estruturas mais quantitativas e permitirá intercomporações entre cepas e condições. Outros esforços para melhorar a capacidade de calibrar medidas de concentração para partículas de < 100nm são necessários.
O fato de as medições da taxa de produção de vesículas serem feitas diretamente a partir de 0,2 μm de cultura filtrada supernante para minimizar perdas de partículas estaria associado a outras etapas de purificação descritas acima. No entanto, isso significa que a abordagem não necessariamente discrimina entre vesículas extracelulares reais e outras pequenas partículas encontradas nas culturas. Apenas contar partículas dentro de faixas de tamanho específicas (por exemplo, 50-250 nm de diâmetro) pode ajudar a excluir alguns outliers, mas a confirmação visual de que o conteúdo de cultura de < 0,2 μm parece ser vesículas ligadas à membrana (por TEM ou outras abordagens) é necessária para ser capaz de afirmar especificamente que se está medindo a produção de vesículas em oposição à produção de partículas semelhantes à vesícula.
Um fator essencial na caracterização da vesícula é garantir que a amostra de vesícula esteja sendo analisada na faixa de sensibilidade linear apropriada do dispositivo de análise de nanopartículas. Quando uma amostra está muito concentrada, é simples diluir esse material com um tampão limpo e re-analisá-lo. Por outro lado, a densidade relativamente baixa de células e/ou vesículas de algumas culturas cianobacterianas pode às vezes produzir preparações vesículas que estão abaixo dos limites de detecção de alguns instrumentos. Nos casos em que isso ocorre com purificações de vesículas a granel, pode-se considerar o crescimento de culturas de volume maior, re-pelotas e reutilização do material final em um volume menor, ou avaliar se há um passo no processo de isolamento onde perdas excessivas estão ocorrendo e podem ser mitigadas. Ao medir as taxas de produção de vesículas, as correções não são necessariamente tão simples. As amostras podem ser concentradas se necessário, mas a primeira deve ver se os ajustes na mídia podem resultar em densidades celulares mais altas ou se amostras suficientemente concentradas poderiam ser obtidas a partir de pontos de tempo posteriores durante a fase exponencial onde as concentrações serão maiores.
Limitações
Como em qualquer protocolo, o isolamento vesícula usando essas abordagens tem claras limitações. Essas abordagens não dependem de sua garantia de que uma preparação totalmente pura de vesículas será isolada. Tanto culturas quanto amostras de campo podem conter outros materiais, que migram de forma semelhante às vesículas em gradientes de densidade. Ainda assim, no mínimo, esses tipos de metodologias adicionais de purificação são essenciais para garantir rigor e reprodutibilidade da análise vesícula. Embora descrevamos abordagens de isolamento vesícula no contexto de cianobactérias, culturas de muitos outros micróbios também conterão vesículas em concentrações relativamente baixas, e os procedimentos aqui descritos devem ser geralmente aplicáveis. Espera-se que esses métodos não sirvam como um protocolo permanente, mas como ponto de partida para estimular avanços futuros no trabalho com vesículas extracelulares de micróbios diversos. Esforços futuros são necessários para fundir esses métodos com outras abordagens, como colunas de exclusão de tamanho ou fracionamento assimétrico de fluxo de campo para melhorar a discriminação e separação de diferentes categorias de pequenas partículas de culturas e amostras ambientais. Também esperamos que essas técnicas possam continuar a evoluir ao lado de melhorias nas tecnologias de caracterização de nanopartículas para melhorar a capacidade de examinar a heterogeneidade dentro das populações vesículas, seus conteúdos e seus papéis funcionais exatos no ambiente.
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem o apoio das plataformas científicas i3S “Biointerfaces e Nanotecnologia”, e “Histologia e Microscopia Eletrônica”, membro da Plataforma Nacional de Bioimagem (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Agradecemos também ao Prof. J. A. Gonzalez-Reyes (Universidade de Córdoba, Espanha) por ajudar a otimizar o protocolo de coloração de seção ultrafina para o TEM, e a Dra.
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciência dos EUA (OCE-2049004 para a SJB), por fundos do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do Programa Operacional compete 2020 para competitividade e internacionalização (POCI), Portugal, 2020, e por recursos portugueses através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior no âmbito do projeto POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 para PO). A Fundação para a Ciência e a Tecnologia também é muito reconhecida pela bolsa de doutorado SFRH/BD/130478/2017 (SL) e pela FCT Investigador grant IF/00256/2015 (PO). M.C.M.M. foi apoiado por uma Bolsa Individual Marie Skłodowska-Curie (painel de reintegração) dentro do Horizon 2020 Framework Program (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Home-made buffer | — | Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially |
2% Uranyl acetate solution | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | Negative staining – TEM |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining |
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) | Merck | UFC9100XX | Alternative option for centrifugal ultrafiltration |
BG11 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803 |
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu | Electron Microscopy Sciences | 71150 | Transmission electron microscopy (TEM) grid |
easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000 | Commercial TEM grid glow discharger |
EMbed 812 epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | Ultra-thin sections – TEM |
Filter holder for vacuum system | Thermo Fisher Scientific | 300-4000 | Reusable units with filter membrane support plates |
Glutaraldehyde Grade I | Sigma-Aldrich | G5882-10X1ml | Ultra-thin sections – TEM |
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] | Sigma-Aldrich | H7006 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
Lead Citrate, Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | Stain for use in electron microscopy |
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K | Pall | MAP100C36 | For centrifugal ultrafiltration of small volume samples |
Millipore Pellicon 3 TFF Module | EMD Millipore | XX42P0060 or XX42P0080 | Alternative TFF option for concentrating large volume samples |
Milli-Q Reference Water Purification System | Merck | Z00QSV0WW | Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water |
NanoSight | Malvern Panalytical | LM14 or NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
Optima L80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L80 XP | Ultracentrifuge (or similar model) |
OptiPrep / Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | Density gradient media |
Osmium Tetroxide Reagent Plus | Sigma-Aldrich | 201030 | Ultra-thin sections – TEM |
Pall Centramate PE TFF holder | Pall Corporation | FS002K10 | TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes |
Peristaltic pump Masterflex L/S | Cole-Parmer | 07559-07 | Pump for driving large-scale TFF modules |
Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments | 152-001 | Automated density gradient fractionation |
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 355618 | Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly |
Pro99 medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of Prochlorococcus |
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | P20495 | LPS staining |
SN medium | Home-made medium | — | Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus |
Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250-100G | Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM |
SW32Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
SW60Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 335650 | Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes |
Syringe 1mL Luer | BD Plastipak | 303172 | For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment |
Syringe filter 0.2 µm | Pall Corporation | 4602 | For vesicle isolation from cultures |
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | T5130 | Buffering agent for cyanobacterial growth media |
Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Or similar microscope |
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter | 337922 | Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material |
Type XIV protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining |
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 344058 | Single use ultracentrifuge tubes |
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor | Beckman Coulter | 344062 | Single use ultracentrifuge tubes |
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC | RMC Products, Boeckeler Instruments | 75501 | Microtome for ultra-thin sections – TEM |
Universal 320 R centrifuge | Hettich | Z654736 | This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells |
Vacuum apparatus | KNF Neuberger | N026.3 AT.18 | Or any similar vacuum pump and trap |
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES | Sartorius | VF20P4 | TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1). |
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) | Cytiva | 6717-9502 | Capsule filter for filtering large volumes of liquid |
Zetasizer | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS | Dynamic light scattering (DLS) instrument |