Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.
Axonaal transport handhaaft neuronale homeostase door de bidirectionele handel van diverse organellen en ladingen mogelijk te maken. Verstoringen in axonaal transport hebben verwoestende gevolgen voor individuele neuronen en hun netwerken en dragen bij aan een overvloed aan neurologische aandoeningen. Omdat veel van deze aandoeningen zowel celautonomische als niet-autonome mechanismen omvatten en vaak een spectrum van pathologie vertonen over neuronale subtypen, zijn methoden om neuronale subsets nauwkeurig te identificeren en te analyseren noodzakelijk.
Dit artikel beschrijft protocollen om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in heupzenuwen van verdoofde muizen te beoordelen. Stapsgewijze instructies worden gegeven om 1) motorische van sensorische neuronen in vivo, in situ jp ex vivo te onderscheiden door muizen te gebruiken die selectief fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in cholinerge motorneuronen; en 2) afzonderlijk of gelijktijdig in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën beoordelen. Deze complementaire intravitale benaderingen vergemakkelijken de gelijktijdige beeldvorming van verschillende ladingen in verschillende perifere zenuwaxonen om axonen kwantitatief het axonale transport in gezondheid en ziekte te monitoren.
Het perifere zenuwstelsel (PNS) verbindt het centrale zenuwstelsel (CZS) met zijn distale doelen, waardoor het relais van efferente signalen motorische controle kan uitoefenen en afferente signalen om sensorische feedback te geven. Met behulp van de vele ontwikkelingen in de muisgenetica hebben wetenschappers verschillende muismodellen ontwikkeld om veel ziekten / syndromen te onderzoeken die de PNS 1,2,3 treffen. Aangezien de meeste neurodegeneratieve pathologieën multifactorieel zijn met celautonomische en niet-autonome bijdragen 4,5, kan het ontwarren van cel- / neuronspecifieke pathologieën cruciale, nieuwe inzichten in ziektemechanismen bieden.
Hiertoe heeft de ontwikkeling van bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) -transgene muizen6 selectieve endogene expressie van fluorescerende eiwitten in gerichte subsets van neuronen mogelijk gemaakt. Er zijn bijvoorbeeld BAC-transgene muizen beschikbaar, die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen in cholinerge7 of glycinerge neuronen8, of een variant rood fluorescerend eiwit (tdTomato) in parvalbumine-positieve neuronen9. Als alternatief kan selectieve neuronale expressie van fluorescerende eiwitten worden bereikt via Cre-loxP-technologie 10. Muisstammen die Cre-recombinase tot expressie brengen in subsets van neuronen (bijv. Choline-acetyltransferase (ChAT)-Cre) kunnen bijvoorbeeld worden gefokt met muizen die een fluorescerend eiwit (bijv. tdTomato of GFP) tot expressie brengen uit een constitutieve locus (bijv. Gt (ROSA) 26Sor) onder controle van een transcriptionele repressor geflankeerd door loxP-sites11 (bijvoorbeeld het genereren van muizen die tdTomato alleen in cholinerge neuronen tot expressie brengen). Inderdaad, met behulp van Cre-loxP-recombinatie zijn transgene muizen gegenereerd die geel fluorescerend eiwit tot expressie brengen in axonen van het dalende corticospinale kanaal12.
Bovendien maken recente ontwikkelingen in CRISPR/Cas9-genbewerking, zoals ORANGE, de fluorescerende tagging van meerdere endogene neuronale eiwitten mogelijk, met expressie haalbaar bij nanoschaalresolutie13. Bovendien kan ORANGE-CAKE, in combinatie met Cre-expressing muizenstammen, worden gebruikt om meerdere endogene eiwitten in individuele neuronen te labelen13. Als alternatief maakt viraal-gemedieerde neuronale tracering ook de etikettering van neuronale subsets mogelijk en kan worden bereikt met gerichte combinaties van virale serotypen en / of celspecifieke promotors 14,15,16,17.
Naast de neuronale etiketteringsmethoden zijn muislijnen ook ontworpen om reportereiwitten tot expressie te brengen die gericht zijn op specifieke organellen, zoals mitochondriën die cyaan fluorescerend eiwit tot expressie brengen (Mito.CFP)18 of autofagosomen die GFP (LC3.GFP)19 tot expressie brengen. Bovendien zijn muislijnen ontworpen om de calciumdynamica specifiek in neuronen te beoordelen (bijv. Thy1.GCaMP)20,21. Al met al, met de vooruitgang van dergelijke modellen, stellen nieuwe experimentele toepassingen wetenschappers in staat om preciezere biologische en pathologische vragen te stellen over het CZS en PNS.
De belangrijkste rol van perifere motorische zenuwen is het verzenden van elektrische signalen naar de skeletspieren om beweging uit te lokken. Bovendien, en optredend over langere tijdschalen, doorkruisen neurochemische en fysiologische berichten in de vorm van diverse organellen (bijv. Mitochondriën, endolysosomen, signaal-endosomen) het cytoskeletale netwerk op een uni- of bidirectionele manier om neuronale homeostase te helpen handhaven 22,23,24. Stoornissen in axonaal transport hebben desastreuze gevolgen voor de neuronale gezondheid en zijn gekoppeld aan veel neurologische en neurodegeneratieve ziekten25. Op moleculair niveau kunnen stoornissen in axonaal transport fysiologische gebeurtenissen verstoren die synaptische signalering en plasticiteit, gentranscriptie en lokale translatie in het axon reguleren26,27. Hoewel er een veelheid aan hulpmiddelen is om deze gebeurtenissen in gekweekte cellen/neuronen te bestuderen28,29, is het beoordelen van axonale transportdynamiek en axonaal gekoppelde biologische gebeurtenissen in vivo vereist om belangrijke inzichten in fysiologische en pathologische processen te bevestigen30.
In de loop der jaren heeft het Schiavo Laboratorium protocollen geoptimaliseerd om diverse vragen te stellen over axonaal transport 31,32,33,34,35,36. Deze experimenten zijn uitgebreid van de ontdekking dat een fluorescerend gelabeld atoxisch fragment van tetanus neurotoxine (HCT) wordt geïnternaliseerd in axonterminals in skeletspieren door interacties met nidogenen en polysialogangliosiden37. Eenmaal geïnternaliseerd, wordt HCT retrograde getransporteerd in Rab7-positieve, neurotrofine-bevattende signaal-endosomen die bestemd zijn voor de cellichamen van motorische en sensorische neuronen 38,39,40,41. Tegelijkertijd heeft de vooruitgang in beeldvormingstechnologie de real-time analyse van perifere zenuwbundels en individuele axonen in levende, verdoofde muizen30 mogelijk gemaakt. De eerste poging tot het beoordelen van in vivo axonale transportdynamiek in de pathologie onthulde presymptomatische stoornissen in het transport van signaal-endosomen en mitochondriën in het SOD1G93A-muismodel van amyotrofische laterale sclerose (ALS)35. Belangrijk is dat het onwaarschijnlijk is dat deze defecten eenvoudigweg secundaire gevolgen van neurodegeneratie vertegenwoordigen, gezien de bevinding dat verlies van motorneuronen kan optreden in afwezigheid van axonale transportverstoringen in een muismodel van kennedy’s ziekte42 en een heterozygoot mutant FUS-model van ALS43. Dergelijke axonale transporttekorten kunnen bij ALS-muizen worden verholpen met behulp van remmers van specifieke kinasen33 of groeifactorreceptoren34. Bovendien verandert de behandeling van neuronen met een specifieke histondeacetylaseblokker mitochondriaal transport in vivo36. Onlangs rapporteren we dat de BDNF-afhankelijke modulatie van axonaal transport ontregeld is in verschillende subtypen van motorneuronen bij ALS-muizen44.
Door gebruik te maken van een steeds groter wordende toolkit voor het beoordelen van axonale transportdynamiek 28,29, schetst dit videoprotocol verschillende toepassingen die verdere inzichten in verschillende biologische en pathologische scenario’s mogelijk maken. Ten eerste worden transgene muizen die selectief fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in cholinerge neuronen (d.w.z. motorneuronen) gebruikt om onderscheid te maken tussen motorische en sensorische axonen, zowel in vivo als ex vivo. Fluorescerend gelabeld HCT wordt vervolgens geladen in signaal-endosomen in drie transgene lijnen om axonale transportdynamiek in verschillende perifere neuronen te differentiëren. Het volgende experimentele protocol beschrijft een multiplex fluorescentiebenadering om mitochondriaal transport specifiek in motorneuronen te beoordelen door ChAT.tdTomato-muizen te fokken met Mito-CFP-muizen. Ten slotte worden instructies gegeven over hoe mitochondriën en signaal-endosomen binnen hetzelfde axon in vivo gelijktijdig in beeld kunnen worden gebracht.
Dit protocol beschrijft stappen om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in intacte axonen van de heupzenuw van de muis te beoordelen. Er is inderdaad een experimentele opstelling die gebruikers in staat stelt om 1) motorische van sensorische neuronen in vivo, in situ jp ex vivo te onderscheiden door muizen te gebruiken die fluorescerende reportereiwitten tot expressie brengen die selectief tot expressie komen in motorneuronen; 2) beoordelen in vivo axonaal transport van signaal-endosomen specifiek in motorneuronen axonen met behulp van drie verschillende transgene muizen; 3) onderzoek in vivo axonaal transport van mitochondriën specifiek in motorneuronen axonen; en 4) gelijktijdig de in vivo transportdynamiek van signalerende endosomen en mitochondriën binnen hetzelfde axon beoordelen. Deze aanpak heeft een enorm potentieel voor het onderzoeken van axonaal transport in basale omstandigheden en kan worden gebruikt om pathologische verstoringen te beoordelen bij verschillende ziekten die perifere motorische en sensorische zenuwen aantasten.
Met behulp van eerdere experimentele paradigma’s als basis31,32, hebben we hier gedetailleerde nieuwe, robuuste manieren om axonaal transport te onderscheiden dat plaatsvindt in motorische versus sensorische neuronen met behulp van transgene reportermuizen. Met behulp van de Mito.CFP-muis is deze aanpak verder ontwikkeld om in vivo mitochondriaal transport te beoordelen door intrasciatische zenuwinjecties van TMRE36 te vermijden. Dit omzeilt mogelijke neurale schade en verstoringen in axonaal transport veroorzaakt door de intranerve injectie van de sonde. Bovendien maakt dit protocol de visualisatie mogelijk van axonaal transport van meerdere organellen in motorische axonen die spieren innerveren met verschillende fysiologische eigenschappen (bijv. Fast-twitch dikbare spieren versus slow-twitch vermoeidheidsbestendige spieren). Als zodanig kan signaal-endosom en /of mitochondriale axonale transportdynamiek worden beoordeeld in verschillende subsets van α-motorneuronen44. Bovendien kan het axonale transport van die organellen in pathologische omgevingen ook worden beoordeeld door kruising met muismodellen van verschillende neurodegeneratieve ziekten 1,2,3.
De axonale transporttoolkit breidt zich voortdurend uit28,29 en er zijn ex vivo protocollen ontwikkeld om de transportdynamiek te beoordelen met behulp van gekweekte muis ventrale hoorn explants49 of weggesneden muiszenuw-spierpreparaten50. Bovendien heeft de ontwikkeling van protocollen voor het beoordelen van axonaal transport in geïnduceerde menselijke pluripotente stamcel (hiPSC) -afgeleide corticale51 neuronen of hiPSC-afgeleide spinale motorneuronen52 onderzoek mogelijk gemaakt van menselijke neuronen met ziekteveroorzakende mutaties. Dergelijke geavanceerde protocollen in muizenweefsel en menselijke cellen kunnen kritische inzichten bieden in de neuronale functie, nieuwe pathomechanistische ontdekkingen in neurodegeneratieve ziektemodellen vergemakkelijken en worden gebruikt om therapeutische moleculen en strategieën te testen.
Verschillende kritieke stappen moeten worden gevolgd voor de succesvolle implementatie van deze technieken, en enkele belangrijke opmerkingen zijn verstrekt in de protocolsectie. De belangrijkste vereisten voor intravitale beeldvorming zijn de omgekeerde confocale microscoop met aangepaste podiuminzet en de apparatuur om anesthesie en optimale temperatuur te behouden. Inderdaad, een gespecialiseerd mobiel anestheticumsysteem is nodig voor 1) inductie van anesthesie, 2) dissectie / weefselverwerking (d.w.z. het blootstellen van de heupzenuw) en 3) het handhaven van anesthesie tijdens intravitale beeldvorming (zoals eerder beschreven in 31,32). Vooral bij het gebruik van hogere vergrotingsdoelstellingen (bijv. 40x of 63x), kan de diepte van de anesthesie de beeldkwaliteit beïnvloeden, omdat diepere anesthesie grote ‘gaspy’ ademhalingen induceert die resulteren in frequente verschuivingen in focus. Dergelijke grote bewegingen zullen ongetwijfeld van invloed zijn op transportanalyses na beeldvorming (bijvoorbeeld het volgen van ladingen met behulp van de Fiji-plug-ins TrackMate53 of KymoAnalyzer54), omdat de ademhalingsbewegingen artefacten produceren in time-lapse-video’s die ze ongeschikt kunnen maken voor geautomatiseerde tracking of meer tijdrovende beoordeling vereisen. Bovendien hebben we ook beeldartefacten waargenomen die worden veroorzaakt door pulserende slagaders in de heupzenuw, die alleen kunnen worden opgelost door een ander beeldvormingsgebied te kiezen. De microscoop moet zijn uitgerust met een omgevingskamer die in staat is een constante lichaamstemperatuur te handhaven, aangezien temperatuur en pH axonaal transport beïnvloeden55. Bovendien moet de toepassing van pijnstillers na de operatie worden vermeden, omdat deze de transportdynamiek kunnen veranderen56. Als het experimentele ontwerp longitudinaal is en herhaalde beeldvorming vereist (bijv.,57), moeten de dissectieprotocollen op de juiste manier worden aangepast om minimaal invasief te zijn en kunnen aanvullende ethische / licentiegoedkeuring vereisen.
Bepaalde experimentele overwegingen moeten in gedachten worden gehouden. Ten eerste omvatten de meeste protocollen die hierin worden beschreven het gebruik van transgene muizen die fluorescerende reportereiwitten bezitten in mitochondriën of motorneuronen. Elk van deze muislijnen moet worden gefokt en afgebeeld als hemi-/heterozygoot. De uitzonderingen zijn echter de ChAT.Cre- en Rosa26.tdTomato-muislijnen die afzonderlijk kunnen worden gehandhaafd als homozygoten, waarbij de resulterende hemizygote-nakomelingen tdTomato-expressie in cholinerge neuronen mogelijk maken na Cre-loxP-recombinatie . Bij het kruisen van transgene hemi-/heterozygote muizen (bijv. Mito.CFP) met andere transgene hemi-/heterozygote muizen (bijv. ChAT.eGFP), moet men de fokstrategie zorgvuldig overwegen, omdat het verkrijgen van de gewenste aantallen dubbel-mutante nakomelingen tijdrovend kan zijn. Bovendien, bij het fokken van de F1-generatie van ChAT.Cre- en Rosa26.tdTomato-muizen (d.w.z. ChAT.tdTomato) met extra transgene stammen (bijv. Mito.CFP), moet men nog minder muizen verwachten die de gewenste drievoudige transgenen dragen. Bovendien moet men ook rekening houden met de potentiële fluorofooroverlapping bij het fokken van twee-reportermuizen met nabijgelegen golflengte-eigenschappen (bijv. Mito-CFP-excitatie: 435 nm, emissie: 485 nm, gefokt met ChAT.eGFP-excitatie: 488 nm, emissie: 510 nm), hoewel het mogelijk kan zijn om dit probleem te overwinnen met spectrale ontmenging58.
Deze techniek heeft enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. In dit werk en onze eerdere protocollen 31,32 hebben we laten zien hoe verschillende genetisch gecodeerde markers en verschillende kleuringsmethoden kunnen worden gebruikt om verschillende organellen in vivo te labelen en te volgen. Niet alle sondes zijn echter geschikt voor deze experimentele aanpak. We beoordeelden injecties in TA of soleus spier van cholera toxine beta subunit (CTB)-488 (0,5-1,5 μg / μL ~ 4 uur vóór beeldvorming), een sonde die routinematig wordt gebruikt om motorneuroncellichamen te labelen in in vivo retrograde tracerexperimenten59,60. Wanneer echter alleen geïnjecteerd of gelijktijdig geïnjecteerd met HCT-555, was de CTB-488-etikettering slecht ondanks het gebruik van concentraties die vergelijkbaar waren met die welke werden gebruikt voor succesvolle retrograde motorneurontracering. We concluderen dus dat, ondanks dat CTB een uitstekende in vitro marker is van signaal-endosomen in neuronale culturen61, HCT de gouden standaard sonde blijft om signalerende endosomen in vivo in heupzenuwaxonen te identificeren.
Met behulp van verschillende routes hebben we ook sondes getest die routinematig worden gebruikt voor het labelen van lysosomen, zoals LysoTracker groen DND-26, en markers van actieve lysosomale hydrolasen, zoals BODIPY-FL-pepstatine A voor Cathepsin D62 en Magic Red voor Cathepsin B, maar zonder succes. We probeerden intramusculaire toediening van BODIPY-FL-pepstatine A (2,5 μg in de TA ~ 4 uur vóór beeldvorming), evenals intrasciatische zenuwinjectie van 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatine A (10 μM) of Magic Red (1/10) 30-60 min vóór beeldvorming. Ondanks deze sondes die de zenuw benadrukten, konden we geen duidelijk gelabelde organellen vinden. De sondes verzamelden zich rond axonen, waarschijnlijk vastgehouden door Schwann-cellen. Vandaar dat de mislukte etikettering van lysosomen te wijten kan zijn aan een gebrekkige sondeafgifte in neuronen, hoewel het bestaan van meer geschikte concentraties niet kan worden uitgesloten. Aangezien TMRE-etikettering onder vergelijkbare omstandigheden werkt (d.w.z. intrasciatische zenuwinjecties), kan de etiketteringsintensiteit kleurstofafhankelijk zijn en moet deze voor elke marker onafhankelijk worden getest. We concluderen echter dat het richten van lysosomen in vivo met deze sondes niet haalbaar is bij de hierboven vermelde concentraties.
Methoden van anesthesie kunnen verschillende fysiologische uitlezingen veranderen (bijv. Cochlea-functie63 en corticale elektrofysiologie64); of anesthesie in vivo axonaal transport in de heupzenuw beïnvloedt, is momenteel echter onbekend. Gezien de verminderde neuromusculaire activiteit onder isofluraan-geïnduceerde anesthesie, is het mogelijk dat transportkinetiek verschilt in vergelijking met de waaktoestand. De enige in vivo studie die dit direct heeft onderzocht, toonde echter aan dat het transport van dichte kernblaasjes in thalamocorticale projecties niet verschilt tussen verdoofde en wakkere muizen65. Bovendien, omdat het onderscheid in transport tussen wildtype en ziektemodelmuizen detecteerbaar is onder anesthesie35,43, is het duidelijk dat blootstelling aan isofluraan de identificatie van perturbances bij het signaleren van endosom of mitochondriale handel niet verhindert.
Dit protocol heeft andere potentiële toepassingen, die hieronder zijn beschreven. Het fokken van de transgene muizen die in dit protocol worden beschreven (bijv. Mito.CFP, ChAT.eGFP) met neurodegeneratieve ziektemuismodellen 1,2,3 zal neuron subtype- en / of ladingspecifiek onderzoek mogelijk maken. Bovendien zouden recent ontwikkelde muis Cre-lijnen66 ook de visualisatie van fluorescerende reportereiwitten in verschillende sensorische axonpopulaties mogelijk maken. Rosa26.tdTomato muizen kunnen bijvoorbeeld worden gekruist met een neuropeptide Y receptor-2-expressing (Npy2r). Cre muis om tdTomato fluorescentie in myeliniseerde A-vezel nociceptoren in te schakelen67. Bovendien kan temporele controle ook worden bereikt door gebruik te maken van induceerbare Cre-systemen (bijv. tamoxifen)68. Een andere mogelijke toepassing is gebaseerd op de beschikbaarheid van transgene muizen die fluorescerende reportereiwitten tot expressie brengen in Schwann-cellen. S100-GFP69– en PLP-GFP70-muizen maken inderdaad in vivo en/of in situ beeldvorming van Schwann-cellen mogelijk en hebben een voortrekkersrol gespeeld in het onderzoek dat betrokken is bij schwann-celmigratie tijdens perifere zenuwregeneratie.
Naast deze toepassingen en als aanvulling op de Mito.CFP-muis is de beschikbaarheid van verschillende transgene muislijnen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in verschillende organellen, zoals mitochondriën en autofagosomen. Het onderzoeken van in vivo mitochondriaal transport zou bijvoorbeeld mogelijk kunnen zijn met de mito::mKate2 muis71 of de fotoconverteerbare mitoDendra muis57. Bovendien kan in vivo mitohagosonotransport mogelijk zijn met behulp van de pH-gevoelige mito-Keima muis72 en de mito-QC muis73 voor mitofagie analyses. Bovendien kunnen de lysosomale etiketteringsproblemen die we tegenkwamen worden overwonnen door muizen te gebruiken die LAMP1-GFP tot expressie brengen, met de kanttekening dat LAMP1 ook aanwezig is in endocytaire organellen die verschillen van lysosomen74.
Samenvattend hebben we nieuwe manieren geboden om in vivo axonaal transport van verschillende organellen in specifieke perifere zenuwaxonen van diverse transgene muizen te beoordelen. De gelijktijdige beeldvorming van verschillende organellen zal bijzonder belangrijk zijn, gezien recente bevindingen van axonale interacties en co-handel van organellen zoals mitochondriën en endosomen 75,76. Wij geloven dat de gepresenteerde methoden nuttig zullen zijn voor het verbeteren van het begrip van de basale fysiologie van axonen in vivo en het ontwarren van belangrijke pathomechanismen die neurodegeneratie van perifere zenuwen aansturen.
The authors have nothing to disclose.
We willen Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) bedanken voor het delen van de ChAT-eGFP, ChAT.Cre en Rosa26.tdTomato muizen, en Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) voor het delen van de HB9. GFP-muis. We willen Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers en Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Junior Non-Clinical Fellowship van de Motor Neuron Disease Association (UK) (Tosolini/Oct20/973-799) (APT), de Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116/Z/15/Z en 223022/Z/21/Z) (GS), een UK Dementia Research Institute Foundation award (GS); en een Medical Research Council Career Development Award (MR/S006990/1) (JNS).
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |