该协议描述了快速高尔基体方法的修改,该方法可以适应神经系统的任何部分,用于染色大鼠海马体和内侧前额叶皮层中的神经元。
高尔基体浸渍,使用具有轻微适应的高尔基染色试剂盒,用于浸渍大鼠海马体和内侧前额叶皮层中的树突状棘。这种技术比以前的高尔基体浸渍方法有了显着的改进,因为预混合的化学物质使用起来更安全,神经元始终浸渍良好,背景碎片少得多,并且对于给定的区域,实验之间的脊柱密度存在极小的偏差。此外,大脑可以在某一点后积累并保持冷冻,直到进一步处理。使用这种方法可以研究任何感兴趣的大脑区域。一旦染色并覆盖滑动,树突状脊柱密度通过计算树突长度的棘数量来确定,并表示为每10μm树突的脊柱密度。
使用重铬酸钾和硝酸银标记神经元的方法首先由Camillo Golgi1,2 描述,随后由Santiago Ramon y Cajal使用,以产生大量区分神经元和神经胶质亚型的工作。最近出版的一本附有他的插图的书现已出版3.在100多年前发表的Ramon y Cajal的研究之后,很少使用高尔基体浸渍。高尔基体浸渍是一个费力的过程,允许用光学显微镜对神经元进行三维可视化。多年来,高尔基体方法进行了多次修改,使方法更容易,染色更一致4。1984年,Gabbott和Somogyi5 描述了单段高尔基体浸渍程序,该程序允许更快速的加工。这种高尔基体浸渍方法需要用4%多聚甲醛和1.5%苦味酸灌注,固定后,然后振动切片到3%重铬酸钾浴中。切片安装在载玻片上,盖玻片的四个角粘合在一起,以便当浸入硝酸银中时,扩散是渐进的。然后将盖玻片弹出,部分脱水,并最终用安装介质永久滑落盖板。该技术被成功地用于标记海马体中的神经元和神经胶质细胞6,7,8 。这里描述的快速高尔基体方法是一种改进,因为重铬酸钾和硝酸银的暴露要少得多,并且不使用多聚甲醛和苦味酸。此外,尽管可以使用Gabbott和Somogyi5 方法的修饰来浸渍的细胞进行分析,但在脱水步骤中,切片通常过度或未充分暴露或从载玻片上掉落,并且通常必须合并几个实验以具有足够的细胞进行分析。
本方案描述了使用高尔基染色试剂盒(见 材料表)来标记大鼠海马体和内侧前额叶皮层(mPFC)中的树突和树突状棘。与以前的方法相比,这种方法的优点是它速度快,研究人员接触有毒化学物质较少,并且神经元染色一致。在许多研究中,下面描述的方案已被用于进行微小的修改,以评估大鼠海马体和mPFC中的树突状脊柱密度9,10,11,12,13,14,15。
本方案描述了一种高尔基体浸渍方法,该方法允许快速同时处理许多切片。这是对前面描述的5 种劳动密集型方法的改进,并且始终产生浸渍神经元进行分析。此外,接触高尔基体浸渍中使用的有毒化学物质较少。该过程中最具挑战性的部分是使切片在幻灯片上保持平坦,这需要大量的练习。使用冷冻喷雾保持所有东西尽可能冷是至关重要的。
一旦载玻片干…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了圣心大学本科生研究计划Grants的支持。
Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |