Um voranzukommen, müssen Wachstumskegel Zugkräfte gegen die äußere Umgebung ausüben. Die Erzeugung von Zugkräften ist abhängig von der Aktindynamik und der Kupplungskupplung. Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zur Analyse der Aktindynamik, der Kupplungskupplung und der Zugkräfte für den Wachstumskegelvorschub.
Um funktionelle Netzwerke aufzubauen, müssen Neuronen zu ihren entsprechenden Zielen wandern und dann Axone in Richtung ihrer Zielzellen ausdehnen. Diese Prozesse hängen von den Fortschritten der Wachstumskegel ab, die sich an den Spitzen der Neuriten befinden. Axonale Wachstumskegel erzeugen treibende Kräfte, indem sie ihre lokale Mikroumgebung wahrnehmen und die Zytoskelettdynamik und Aktinadhäsionskopplung (Kupplungskopplung) modulieren. Jahrzehntelange Forschung hat zur Identifizierung von Leitmolekülen, ihren Rezeptoren und nachgeschalteten Signalkaskaden zur Regulierung der neuronalen Migration und der axonalen Führung geführt; Die molekularen Maschinen, die zur Erzeugung von Kräften erforderlich sind, um den Wachstumskegelvorschub und die Navigation voranzutreiben, werden jedoch gerade erst aufgeklärt. An der Vorderkante neuronaler Wachstumskegel durchlaufen Aktinfilamente einen retrograden Fluss, der durch Aktinpolymerisation und Actomyosinkontraktion angetrieben wird. Eine Kupplungskopplung zwischen F-Aktin retrogradem Flow und Klebesubstrat erzeugt Zugkräfte für den Wachstumskegelvorschub. Die vorliegende Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Überwachung des retrograden F-Aktinflusses durch Single-Speckle-Bildgebung. Wichtig ist, dass diese Technik in Kombination mit einem F-Aktin-Marker Lifeact 1) die F-Aktin-Polymerisationsrate und 2) die Kupplungskopplungseffizienz zwischen dem retrograden F-Aktin-Fluss und dem Klebstoffsubstrat quantifizieren kann. Beides sind kritische Variablen für die Erzeugung von Kräften für den Wachstumskegelvorschub und die Navigation. Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Studie ein detailliertes Protokoll der Zugkraftmikroskopie, das 3) die von Wachstumskegeln erzeugte Zugkraft quantifizieren kann. Durch die Kopplung der Analysen der Einzelfleckenbildgebung und der Zugkraftmikroskopie können die Forscher die molekulare Mechanik überwachen, die dem Wachstumskegelfortschritt und der Navigation zugrunde liegt.
Im sich entwickelnden Wirbeltiergehirn durchlaufen Neuronen aufwendig organisierte Migrationen und projizieren Axone in Richtung geeigneter synaptischer Partner, um funktionelle neuronale Netzwerke aufzubauen1,2,3. Wachstumskegel, die sensorische und bewegliche Strukturen an der Spitze von Neuriten sind, bestimmen die Geschwindigkeit und Richtung der neuronalen Migration und des Axonauswuchses3,4,5. Da Neuronen von dicht gedrängten Umgebungen umgeben sind, müssen Wachstumszapfen Kräfte gegen ihre Umgebung ausüben, um sich vorwärts zu bewegen6,7. Um die Mechanismen zu verstehen, die der neuronalen Migration und der axonalen Führung zugrunde liegen, sind Analysen der molekularen Mechanik für den Wachstumskegelfortschritt unerlässlich.
Jahrzehntelange Analysen haben ergeben, dass die Zugkraft zur Förderung des Wachstumskegels durch den “Kupplungsmechanismus” erzeugt wird. Es wird angenommen, dass dieser Mechanismus nicht nur im axonalen Wachstumskegel funktioniert, sondern auch im führenden Prozesswachstumskegel wandernder Neuronen8,9,10,11,12. Aktinfilamente (F-Aktine) in Wachstumskegeln polymerisieren nämlich an der vorderen Kante und depolymerisieren proximal, wodurch die vordere Membran herausgedrückt wird13,14,15. Die resultierende Kraft induziert in Verbindung mit der Actomyosinkontraktion eine Rückwärtsbewegung von F-Aktinen, die als retrograder Fluss bezeichnet werden7,11,16,17,18,19,20,21. Kupplungs- und Zelladhäsionsmoleküle vermitteln die mechanische Kopplung zwischen F-Aktin retrogradem Fluss und dem Klebstoffsubstrat und übertragen die Kraft des F-Aktinflusses auf das Substrat, wodurch Zugkraft für den Wachstumskegelfortschritt erzeugt wird7,8,9,11,12,22 . Gleichzeitig reduziert die Aktin-Substrat-Kopplung die F-Aktin-Strömungsgeschwindigkeit und wandelt die Aktinpolymerisation in die Kraft um, die die vordere Membran hervorsteht9,10.
Axonale Wachstumskegel spüren lokale chemische Hinweise und wandeln sie in eine richtungsweisende treibende Kraft für die Wachstumskegelnavigation um3,23,24,25. Zum Beispiel stimuliert ein Axon-Leitmolekül Netrin-1 seinen Rezeptor, der bei Darmkrebs (DCC) gelöscht wurde, und aktiviert die Rho-Guanosintriphosphat (GTP)-bindenden Proteine Zellteilungskontrollprotein 42 (Cdc42) und Ras-assoziiertes C3-Botulinumtoxinsubstrat 1 (Rac1) und ihre nachgeschaltete Kinase p21-aktivierte Kinase 1 (Pak1) 26. Cdc42 und Rac1 fördern 1) Aktinpolymerisation, und Pak1 phosphoryliert ein Kupplungsmolekül Shootin122,26. Shootin1 interagiert mit dem retrograden F-Aktin-Fluss über ein Aktin-bindendes Protein Cortactin27. Shootin1 interagiert auch mit dem L1-Zelladhäsionsmolekül (L1-CAM)20,24. Die Shootin1-Phosphorylierung erhöht die Bindungsaffinitäten für Cortactin und L1-CAM und verbessert die Shootin1-vermittelte 2)-Kupplungskopplung24,27. Innerhalb des Wachstumskegels erhöhen asymmetrische Aktivierungen der Aktinpolymerisation und der Kupplungskopplung 3) die Zugkraft auf der Seite der Netrin-1-Quelle und erzeugen dadurch eine gerichtete Antriebskraft für die Wachstumskegeldrehung (Abbildung 1)24. Die intensive Forschung der letzten Jahrzehnte in Bezug auf neuronale Migration und Axonführung hat das Verständnis von Leitmolekülen, ihren Rezeptoren und den damit verbundenen nachgeschalteten Signalkaskaden verbessert2,10,28,29,30. Die molekularen Maschinen zur Erzeugung von Kräften für den Wachstumskegelfortschritt beginnen jedoch gerade erst, aufgeklärt zu werden; dies kann auf die begrenzte Verwendung der Protokolle für mechanobiologische Analysen zurückgeführt werden.
Die vorliegende Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Überwachung des retrograden F-Aktin-Flusses durch Single-Speckle-Bildgebung16,18. Die Überwachung des retrograden F-Aktin-Flusses wurde ausgiebig mit hochauflösender Mikroskopie, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und TIRF-Mikroskopie (Total Interference Reflection Fluorescence) durchgeführt25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Das Protokoll in der vorliegenden Studie verwendet jedoch ein Standard-Epifluoreszenzmikroskop und ist daher leicht zu übernehmen11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. In Kombination mit der F-Aktin-Markierung durch Lifeact43 ermöglicht die Single-Speckle-Bildgebung eine Quantifizierung der Aktinpolymerisationsrate und der Kupplungskopplungseffizienz zwischen dem retrograden F-Aktin-Fluss und dem Klebstoffsubstrat39,42. Die vorliegende Studie beschreibt ferner ein detailliertes Protokoll der Zugkraftmikroskopie unter Verwendung eines fluoreszierenden, in Die Perle eingebetteten Polyacrylamid (PAA)-Gels11,22,23,24,27,39,41,42,44. Diese Methode erkennt und quantifiziert die Zugkraft unter dem Wachstumskegel durch Überwachung der kraftinduzierten Perlenbewegungen44,45. Ein Open-Source-Zugkraftanalysecode wird bereitgestellt, und die Methode zur Quantifizierung der Zugkraft während der Wachstumskegelmigration wird ausführlich erläutert. Mit Hilfe der Einzelfleckenbildgebung und der Zugkraftmikroskopie wird das Verständnis der molekularen Mechanik, die der Migration und Navigation von Wachstumskegeln zugrunde liegt, erleichtert. Diese Techniken sind auch zur Analyse der molekularen Mechanik anwendbar, die der dendritischen Wirbelsäulenvergrößerung zugrunde liegt, von der bekannt ist, dass sie für das Lernen und das Gedächtnis wichtig ist42.
Die in dieser Studie beschriebenen Protokolle verwenden kommerziell verfügbare Materialien und Mikroskopiegeräte, die routinemäßig in allen Labors, Instituten und Universitäten zu finden sind. Daher können Forscher die vorliegende Einzelfleckenbildgebung und Zugkraftmikroskopie leicht in ihre Studien einbeziehen.
Die Speckle-Bildgebung kann Aktinpolymerisation und Kupplungskopplung analysieren. Darüber hinaus kann die Speckle-Bildgebung den retrograden Fluss von Kupplungsmolekülen wie Shootin1 und Cortactin überwachen, die mit dem retrograden F-Aktin-Fluss interagieren. Mit einem TIRF-Mikroskop kann auch der retrograde Fluss des Zelladhäsionsmoleküls L1-CAM überwacht werden23,41; L1-CAM erfährt ein Griff- und Schlupfverhalten, das die Effizienz der Kupplungskupplung widerspiegelt23,41. Obwohl die vorliegende Studie das TMR-HaloTag-System für die Speckle-Bildgebung verwendet, sind auch andere fluoreszierende Proteine wie EGFP und monomeres rot fluoreszierendes Protein in der Analyse verfügbar16,18,20,23,24,27,39. Die Grundlagen für die Visualisierung von Aktinflecken sind ein niedriges Expressionsniveau von fluoreszierendem Aktin und die Beleuchtung einer minimalen Fläche (Abbildung 2). In diesem Protokoll werden Lifeact- und HaloTag-Aktinsignale nacheinander erfasst. Da der retrograde Aktinfluss relativ langsam ist (4,5 ± 0,1 μm/min)24, wird die Analyse des retrograden F-Aktinflusses und der Aktinpolymerisation durch die sequentielle Bildaufnahme verschiedener Fluoreszenzkanäle (~1 s-Intervall) nicht beeinflusst. Lifeact ist ein weit verbreiteter F-Aktin-Marker, kann aber mit Aktin-bindenden Proteinen konkurrieren47. Von weiterer Bedeutung ist, dass Lifeact die Aktindynamik verändern kann, wodurch F-Aktinstrukturen und die Zellmorphologie beeinflusst werden47,48,49.
Die Zugkraftmikroskopie kann Kräfte erkennen, um den Wachstumskegelvorschub voranzutreiben. Durch die Montage der Neuronen in einer extrazellulären Matrix können die Forscher auch Kräfte analysieren, die in einer Semi-3D-Umgebung erzeugt werden11. Die Bildgebung mit hoher Vergrößerung ist wichtig für die genaue Quantifizierung der Zugkraft, da Wachstumskegel schwache Zugkräfte erzeugen7. Obwohl auch andere Methoden mit Nanosäulen oder spannungsempfindlichen Biosensoren zur Messung der Zugkraft verwendet werden50,51, ist die PAA-Gel-basierte Methode sehr anpassungsfähig und ermöglicht die Einstellung der Substratsteifigkeit durch Variation der Konzentrationen von Acrylamid und Bisacrylamid41,44,52. In diesem Protokoll wird das PAA-Gel in einer Endkonzentration von 3,75% Acrylamid und 0,03% Bisacrylamid hergestellt; Der Elastizitätsmodul beträgt ~ 270 Pa22 und diese Steifigkeit liegt im Bereich des Hirngewebes (100-10.000 Pa) 53,54,55. Aufgrund der Dicke des PAA-Gels (~100 μm) schränkt diese Methode die Verwendung von Linsen mit hoher Vergrößerung während der Mikroskopie ein. Um Bilder mit hoher Vergrößerung zu erhalten, sollten Forscher die Zoomfunktion in einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop verwenden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Speckle-Bildgebung und die Zugkraftmikroskopie quantitative Analysen der Schlüsselereignisse in der Krafterzeugung ermöglichen. Diese Informationen werden von unschätzbarem Wert sein, um das Verständnis der Mechanismen zu verbessern, die dem Fortschritt und der Navigation des Wachstumskegels zugrunde liegen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde teilweise von AMED unter der Fördernummer 21gm0810011h0005 (N.I. und Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) und JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), der Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.) und dem NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.) unterstützt.
0.5% trypan blue stain solution | Nacalai | 29853-34 | |
3-aminopropyltrimethyoxysilane | Sigma | 281778-100ML | |
Acrylamide monomer | Nacalai | 00809-85 | |
Ammonium persulphate | Cytiva | 17-1311-1 | |
Axio Observer Z1 | Zeiss | 431007-9902-000 | Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging) |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Bovine serum albmine | Sigma | A7906-10G | |
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr | Zeiss | 421787-9970-799 | Objective lens (traction force microscopy) |
Coverslip (diameter 18 mm) | Matsunami | C018001 | |
D-glucose | Nacalai | 16806-25 | |
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
Fiji | Open source software package | https://imagej.net/software/fiji/ | |
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid | Thermo Fisher Scientific | F8810 | carboxylate-modified microspheres |
Glass bottom dish (14 mm diameter) | Matsunami | D1130H | |
Glass bottom dish (27 mm diameter) | Matsunami | D1140H | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882-10X10ML | |
HaloTag TMR ligand | Promega | G8251 | |
HBO103 W/2 | Osram | 4050300382128 | Mercury lamp (single speckle imaging) |
Image Processing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/image.html | |
Laminin solution from mouse EHS tumor | Wako | 120-05751 | |
Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
L-glutamine | Nacalai | 16919-42 | |
LSM710 | Zeiss | N/A | Conforcal laser microscope (traction force microscopy) |
MATLAB2018a | MathWork | https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html | |
Mouse C57BL/6 | Japan SLC | N/A | |
Mouse neuron nucleofector kit | Lonza | VPG-1001 | |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai | 33401-72 | |
N,N’-methylenebisacrylamide | Nacalai | 22402-02 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
Nucleofector I | Amaxa | AAD-1001 | Electroporation apparatus |
ORCA Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | C11440-22CU | CMOS camera (single speckle imaging) |
Papain | Nacalai | 26036-34 | |
Parallel Computing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html | |
pEGFP-C1 | Clontech | 1528177 | |
Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
pFN21A-HaloTag-actin | (Minegishi et al., 2018) | N/A | |
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil | Zeiss | 420790-9901-000 | Objective lens (single speckle imaging) |
pmNeonGreen-N1-Lifeact | (Kastian et al., 2021) | N/A | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P6407-5MG | |
Slulfo-SAMPHA | Thermo Fisher Scientific | 22589 | |
Sodium dodecyl sulfate | Nacalai | 08933-05 | |
Sodium hydrate (NaOH) | Nacalai | 31511-05 | |
Steel ball | Sako tekkou | N/A | Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3. |
ZEN2009 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (traction force microscopy) |
ZEN2012 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (single speckle imaging) |