이 문서는 성인 Drosophila 에 관통 외상성 뇌 손상을 입히고 결과 신경 발생을 검사하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
질병 이나 상해에 응하여 신경 발생의 근본적인 분자 및 세포 기계장치는 잘 이해되지 않습니다. 그러나, 이 기계장치를 이해하는 것은 신경 재생 성 치료를 개발하기 위한 중요합니다. Drosophila 멜라노가스터 는 신경 발달의 연구를 위한 주요한 모형입니다 그러나 역사적으로 성인 두뇌 재생을 조사하기 위하여 이용되지 않았습니다. 이것은 성인 두뇌가 아주 낮은 미토Tic 활동을 전시하기 때문에 주로 입니다. 그럼에도 불구 하 고, 성인 Drosophila 중앙 두뇌에 외상성 뇌 손상 (PTBI)을 관통 새로운 뉴런과 새로운 신경의 생성을 트리거. Drosophila 에서 사용할 수 있는 강력한 유전 도구는 여기에서 기술된 간단하지만 엄격한 상해 프로토콜과 결합하여 지금 성인 Drosophila 두뇌신경 재생 연구를 위한 강력한 모형을 만듭니다. 여기에 제공 (1) 성인 중앙 뇌에 관통 부상과 (2) 해부, 면역 조직 화학, 및 화상 진전에 대한 자세한 지침이 제공됩니다. 이러한 프로토콜은 매우 재현 가능한 결과를 생성하고 신경 재생의 기본 메커니즘을 해부하기 위한 추가 연구를 용이하게 합니다.
뇌와 신경계의 손상은 전 세계적으로 사망과 장애의 주요 원인입니다. 대략 150만 명의 미국인은 매년 외상성 뇌 손상 (TBI)를 겪고, 미국에 있는 추정된 6백만명의 개별은 파킨슨병과 알츠하이머 병2와 같은 신경 퇴행성 질병 때문에 손해를 입는 동안 11. 뇌의 질병과 부상은 신경 변성을 유발하여 감각, 인지 및 운동 결함으로 이어질 수 있습니다3. 인간의 뇌 수리를 위한 치료 전략을 개발하는 것은 두뇌의 복잡한 생리학 때문에 어려웠습니다. Drosophila melanogaster 와 같은 모형 유기체는 신경 변성 및 잠재적인 치료 표적4의 근본적인 기계장치를 확인하기 위한 간단한 시스템을 제공합니다4.
과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터는 유전학, 발달 생물학 및 신경 과학의 분야를 발전시키는 100 년 이상 강력한 모델 유기체였습니다5,6. Drosophila 두뇌는 단지 ~90,000 뉴런7, 평균 인간 brain8 보다는 백만 배 더 적은, 그러나 많은 유사점이 있습니다. 인간과 비행 두뇌 모두 신경 전달 물질 GABA를 활용, 조미료, 아 세 틸 콜린, 그리고 생물 성 아민 도파민과 세로토닌9. Drosophila와 인간 뉴런은 또한 공유 시냅스 아키텍처와 유사한 신경 세포 유형10과 함께 유사하게 작동합니다. Drosophila의 작은 두뇌 크기와 고급 유전학 기술의 가용성, 분자의 보존과 함께, 세포, 그리고 Drosophila와 포유류 사이 생리적인 기계장치, Drosophila 연구원은 포유류 모형에서 대답하기 어려운 질문을 하는 것을 허용합니다.
Drosophila에 있는 성인 신경 발생의 우리의 현재 이해는, 항상성 도중 그리고 상해를 따르는 둘 다, 제한남아 있습니다. 더 일반적인 발달 도중 신경 발생에 관하여 알려지는. 예를 들면, 신경 세포및 glia는 신경 폭발10,11에게 불린 전구체 세포에서 발달 하는 동안 생성됩니다. 신경 폭발의 적어도 3 개의 다른 유형중앙 두뇌에서 구별 되었습니다. 타입 I 와 타입 II 계보 신경 폭발 모두 puparium 형성 후 세포 주기 ~20-30 h를 종료합니다12. 대조적으로, 버섯 체 신경폭발은 세포 분열을 종료하고 puparium 형성 후 사신 의존 식 석멸을 통해 이렇게 하는 마지막입니다 .85-90 h. 백과 사 후, 성인 Drosophila 뇌는 몇 분할 세포 (~1 세포/두뇌), 주로 glia14. 성인 광학 엽은 천천히 신경 발생을 할 수있는 신경 폭발을 가지고15, 성인 중앙 뇌는 알려진 신경 폭발이없는 동안. 신경 전조자와 제한된 세포 증식의 희소성은 성인용 포유류 뇌의 상황과 강하게 유사하며, Drosophila에서 성인 신경 발생 메커니즘의 잠재적 관련성을 인간에게 강조합니다.
상해 후 성인 Drosophila 광학 엽에서 성인 신경 발생의 낮은 수준의 발견15 성인 Drosophila 중앙 두뇌또한 성인 신경 발생16 할 수 있다는 가설을 주도. 이 프로토콜은 성인 중앙 두뇌에 있는 신경 발생을 조사하는 데 사용할 수 있는 성인 Drosophila 에 있는 중앙 두뇌 상해의 엄격하고 재현가능한 모형을 만드는 것을 기술합니다. 인간과 Drosophila 두뇌 건축 및 기능 사이 유사성을 감안할 때, 이 발견은 다치고 병받은 인간 두뇌에 있는 치료 신경 발생을 위한 중요한 표적의 확인으로 이끌어 낼 수 있었습니다.
비록 성인 Drosophila 두뇌에 관통 부상 이전에 설명 되었습니다 15,17,18, 이러한 부상 시안경 엽에 초점을 맞춘 하지 중앙 두뇌. 또한, 부상을 수행하는 방법에 대한 자세한 지침은 지금까지 부족하다. 이 프로토콜은 PTBI 후에 성인 신경 발생에 대한 통계적으로 유의한 증거를 재현성인 Drosophila 중앙 두뇌에 관통 상해를 위한 모형을 기술합니다.
이 PTBI 프로토콜의 재현성은 부분적으로, 부상 표적 영역으로 버섯 본문에 기인한다. 버섯 본체는 크고, ~2200뉴런으로 구성되어 있으며, 크고 고정관된 배열18에서 복잡한 원더라이트와 축슨 아버를 가진 뉴런이 있다. 버섯 체뉴런의 세포체는 뇌 표면 근처에 놓여 있으며 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 사용하여 머리 표피를 통해 시각화될 수 있다(도 1C). 버섯 체전구체는 발달 중에 세포멸을 겪는 마지막 신경 줄기 세포입니다13,12,19. 따라서, 많은 버섯 몸 뉴런은 백과의 시간에 꽤 젊은. 이 버섯 시체 다른 뇌 영역 보다 더 많은 미토 성 잠재력을 가질 수 있습니다 가설주도16. 또한, 버섯 몸은 학습 및 메모리18에 대 한 중요 한. 이것은 PTBI 트리거신경 발생이 기능적인 회복으로 이끌어 내는지 물어볼 수 있습니다.
결과의 재현성에 기여하는 그밖 요인은 일관된 유전자형의 교차된 파리를 사용하여, 매번 같은 방향으로 십자가를 수행하고, 정확하게 양육 및 노화 온도를 통제하고, 남성과 여성을 개별적으로 분석하는 것을 포함합니다. 아웃 크로스에서 F1 파리를 사용하면 자발적인 돌연변이에 대한 뇌균질 분석 확률이 줄어듭니다. y[1] w[1]의 표준 십자가; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 성인 여성 y[1] w[1] 성인 남성 파리 는 유전자형 y[1] w[1]의 F1 자손귀에서 발생; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 는 버섯 체의 모든 본질적인 뉴런으로 표현되며, 버섯 체의 시각화를 허용하는 막 바인딩 기자 UAS-mCD8-GFP 의 발현을 구동한다. 퍼마 트윈 크로스의 경우, 계보 추적 시스템을 끄려면 항상 17°C에 남아 있어야 합니다. 이것은 어떤 분할 세포가 발달 도중 표지되지 않으며 성인 출생 신경및 glia만 표지된다는 것을 보장합니다. 이를 위해 플라이룸은 17°C에서 유지될 수도 있다. 퍼마 트윈 system15 권장 사육 파리의 초기 설명은 18°C에서 권장되지만, 이는 상당한 배경 라벨링으로 이어질 수 있다.
일관성을 위해, 또한 하나의 PTBI를 수행으로 CO2 패드에 부상없는 파리 제어를 유지하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 두 파리 세트모두 동일한 마취 노출을 보장합니다. 또한, 재현성이 머리를 완전히 관통하는 것이 바람직하다. 그러나, 패드에 대한 핀의 끝을 구부리지 않도록주의해야하므로 향후 부상에 사용할 수 없습니다. 숙련 된 실무자의 경우 PTBI 파리에 의도하지 않은 피해가 거의 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 흉부에 너무 열심히 누르면 부상 하는 동안 비행을 안정화 하는 치명적인 수 있습니다. 의도하지 않은 부상의 정도를 평가하는 한 가지 방법은 PTBI의 사망률을 24시간 후 의 비행으로 정량화하는 것입니다. 일방적으로 다친 파리의 경우 초보자에게는 50% 이상일 수 있습니다. 따라서 관찰된 결과가 PTBI에 의한 것이지 의도하지 않은 부상이 아니라는 것을 보장하기 위해, 초보자는 몇 주 동안 매일 ~20 파리에 PTBI를 투여하는 연습을 하고 24h 사망률이 일관되게 <10%가 될 때까지 결과된 뇌를 분석하지 않는 것이 좋습니다.
중앙 뇌 PTBI에 의해 자극된 증식의 양을 정량화하기 위해, 항인지질성 H3(PH3) 면역염색 및 5-에티닐-2′-데옥시리딘(EdU) 혼재를 모두 사용할 수 있다. 반대로 PH3는 메타Phase 전후에 걸쳐 세포를 라벨, 적극적으로 분할 세포의 일부에 검출을 제한. 따라서, 안티 PH3 염색은 확산의 부분적인 엿볼만 제공합니다. EdU는 새로 합성된 DNA에 통합될 수 있는 티미딘 아날로그입니다. 부상 전후에 EdU를 먹이면 부상 전후에 분할되거나 분열된 세포의 보다 완전한 그림을 얻을 수 있습니다. 분할하는 모든 세포가 영구적으로 표시된다는 사실은 천천히 사이클링 세포의 식별과 초기 증식 후 세포의 생존을 분석하는 데 모두 도움이됩니다. 불분명 한 이유로, 하지만 어쩌면 혈액-뇌 장벽의 제한 된 투과성 으로 인해, EdU 라벨은 비효율적이 고 성인 두뇌에 있는 세포 증식을 보고. 이것은 24 h PTBI에서 제어 및 실험 두뇌 둘 다에 있는 PH3+ 및 EdU+ 세포의 유사한 수에 의해 증명되고 perma-twin 클론에 있는 새로운 세포의 단지 하위 집합이 EdU16를 통합한다는 것을 관찰해서. 최대 라벨링의 경우, 부상당한 파리가 PTBI 이후 몇 시간 동안 먹이를 재개하지 않기 때문에 EdU로 파리를 미리 공급하는 것이 필수적입니다. 수유는 EdU 용액에 식품 착색을 추가하고 복부 cuticle16을 통해 창자에 있는 염료의 양을 모니터링하여 평가되었습니다.
우리가 4 단계에서 뇌 해부 프로토콜을 제공했지만 대체 기술이 사용될 수 있다는 점에 유의해야합니다. 이들 중 일부는 이전에 게시된 프로토콜20,21,22에서 사용할 수 있습니다. Drosophila melanogaster는 신경계의 창자 및 분대를 포함하여 다중 조직의 근본적인 재생기장치를 연구하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 유전 및 분자 공구를 가진 저비용 모형을 제공합니다. 뇌 손상에 대한 반응을 연구하는 데 사용할 수있는 새로운 재현 가능한 부상 모델이 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터는 성인 Drosophila 중앙 두뇌가 증식 능력을 유지한다는 아이디어를 지원, 부상에 대한 응답으로 새로운 뉴런을 생성. 이러한 관측은 성인 신경 발생의 정도와 그것의 근본적인 분자 기계장치의 추가 조사를 보증합니다. 일단 신경 재생에 관련된 분대는 이 시스템에서 확인되면, 우리는 인간에게 성인 Drosophila 신경 발생의 우리의 지식을 변환할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
스테이시 림쿠스와 베키 카첸버거에게 기술 지원을 드리고, 에두아르도 모레노에게 퍼마 트윈 주식을 공유해 주셔서 감사합니다. 우리는 의심 할 여지없이 과학을 개선하고 켄트 목, 카일라 게라, 베일리 슈피겔 버그가 실험실에 기여해 준 활기찬 토론에 배리 가네츠키와 데이비드 바사르만에게 감사드립니다. FasII 항체는 코리 굿맨에 의해 개발되고 NIH의 NICHD에 의해 생성되고 아이오와 대학, 생물학부, 아이오와 시, IA 52242에서 유지 개발 연구 하이브리드 종 은행에서 얻은. 이 연구에서 사용되는 드로소필라 균주의 대부분은 블루밍턴 드로소필라 스톡 센터(BDSC)로부터 얻어졌다. NIH P40OD018537). 이 작품은 NIH T32 GM007133 (KLC)에 의해 지원되었다; NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); 위스콘신 대학교 대학원(GBF); 과학 및 공학 리더십 연구소 (WISELI)의 UW-매디슨 여성 (GBF).
#11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
Microscope slides | any | for mounting brains | |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |