概要

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

Published: July 01, 2022
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概要

ここでは、10 ng/mL GM-CSF/IL-4で7日間培養した後、マウスから高純度骨髄由来樹状細胞を単離・生成する経済的かつ効率的な方法を紹介します。

Abstract

樹状細胞(DC)の需要は、免疫学研究が進むにつれて徐々に増加しています。しかし、DCはすべての組織において稀である。DCを単離するための従来の方法は、主に、顆粒球 – マクロファージコロニー刺激因子/インターロイキン−4(GM-CSF/IL-4)を大量(>10ng/mL)注射することによって骨髄(BM)をDCに分化させることを含み、手順を複雑かつ高価にする。このプロトコールでは、10 ng/mL GM-CSF/IL-4培地で培養したすべてのBM細胞を用いて、3〜4回の半培養交換の後、マウス(2つの大腿骨)あたり最大2.7 x107個の CD11c+ 細胞(DC)を純度80%〜95%で回収した。培養10日後、CD11c、CD80、およびMHC IIの発現は増加したが、細胞数は減少した。細胞数は培養7日後にピークに達した。さらに、この方法は、すべての骨髄細胞を採取するのに10分しかかからず、培養1週間後に多数のDCが得られた。

Introduction

樹状細胞(DC)は、ナイーブT細胞を活性化し、感染症、アレルギー疾患、および腫瘍細胞に対して特異的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘導するための最も強力な抗原提示細胞(APC)である1,2,3DCは自然免疫と獲得免疫との間の主要なリンクであり、免疫学的防御および免疫寛容の維持に不可欠な役割を果たす。過去40年間、多くの研究者がDCのサブセットと炎症と免疫におけるその機能を定義しようとしてきました。これらの研究によると、DCは骨髄細胞からの骨髄系およびリンパ系に沿って発達する。腫瘍ワクチンは近年、重要なマイルストーンを獲得し、有望な未来を持っています。機械的には、腫瘍ワクチンは、腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Tリンパ球を活性化することによって免疫応答を調節し、腫瘍増殖を防止する。DCに基づくワクチンは、腫瘍免疫療法において重要な役割を果たしており、最も有望な抗腫瘍療法の1つとして同定されている1,4。さらに、DCは、新しい分子標的薬および免疫チェックポイント阻害剤の試験に広く使用されている5

研究者は、DCの役割をさらに研究するために、多数の高純度DCを緊急に必要としています。しかし、DCは様々な組織や血液ではまれであり、ヒトや動物の血球のわずか1%しか占めていません。骨髄樹状細胞(BMDC)の 体外 培養は、大量のDC細胞を得るための重要な方法である。一方、骨髄からDCを生成するためのLutzプロトコルは、研究者によって広く使用されています6。このプロトコルはDC細胞を得るのに有効であるが、複雑で高価であり、高濃度のサイトカインの添加および赤血球の溶解を伴う。

本研究では、マウス骨髄(BM)からほぼすべての骨髄細胞を単離し、GM-CSFおよびIL-4の濃度を低くして、 インビトロでの7~9日後のBMDCへの分化誘導方法を報告する。この手順は、ほとんどすべての骨髄細胞を採取し、それらを完全な培地に懸濁するのに10分しかかかりません。簡単に言えば、我々はこの研究においてBMDCのための効率的かつ費用対効果の高い培養方法を提供する。

Protocol

すべての手順は、南京医科大学動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。 骨髄の単離とBM細胞の調製 C57BL/6マウス(18~22g、6~8週齢)をCO2 窒息で屠殺する。マウスを操作台に固定します。表面を70%エタノールで消毒する。 脚の皮膚を切って筋肉と大腿動脈を露出させます。2つの鉗子を使用して大腿動脈を締め付けて引き裂き、?…

Representative Results

1 x 107-1.7 x107細胞を2つの大腿骨から抽出し、6ウェルプレートに植え付ける前に24 mLの培地に再懸濁した(図1A)。2日後、培養液を完全に交換して非接着細胞を除去した。培地を交換する前に、かなりの数の浮遊細胞が観察された(図1B)。培養の3日後、小細胞コロニーが形成され始めた。6日目に、コロニーのサイズと数は大幅に増加し?…

Discussion

ヒトおよびマウスは、古典的なDC(cDC、cDC1およびcDC2を含む)、形質細胞様DC(pDC)、および単球由来DC(MoDC)を含む異なるDCサブセットを有する91011。cDC1sは細胞内病原体および癌に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を調節し、cDC2sは細胞外病原体、寄生虫、およびアレルゲンに対する免疫応答を調節することが一般に受け入?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、天津科学技術計画プログラム(20JCQNJC00550)、天津健康科学技術プロジェクト(TJWJ202021QN033およびTJWJ202021QN034)の支援を受けました。

Materials

β-Mercaptoethanol Solarbio M8211
6-well plate Corning 3516
APC-MHC II Biolegend 116417
FBS Gibco 10100
PE-CD80 Biolegend 104707
Penicillin-Streptomycin Solarbio P1400
Percp/cy5.5-CD11c Biolegend 117327
PRMI-1640 Thermo 11875093
Recombinant Mouse GM-CSF Solarbio P00184
Recombinant Mouse IL-4 Solarbio P00196
TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend 156603

参考文献

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記事を引用
Tang, H., Xie, H., Wang, Z., Peng, S., Ni, W., Guo, L. Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice. J. Vis. Exp. (185), e63125, doi:10.3791/63125 (2022).

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