Aquí, presentamos un protocolo para evaluar las actividades neuroprotectoras de los compuestos de prueba en Caenorhabditis elegans, incluida la agregación de poliglutamina, la muerte neuronal y el comportamiento de quimioavoidencia, así como una integración ejemplar de múltiples fenotipos.
El plegamiento incorrecto relacionado con la edad y la agregación de proteínas patógenas son responsables de varias enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, la enfermedad de Huntington (EH) es impulsada principalmente por una repetición de nucleótido CAG que codifica un tracto de glutamina expandido en la proteína huntingtina. Por lo tanto, la inhibición de la agregación de poliglutamina (polyQ) y, en particular, la neurotoxicidad asociada a la agregación es una estrategia útil para la prevención de la EH y otras afecciones asociadas a la poliQ. Este artículo introduce protocolos experimentales generalizados para evaluar la capacidad neuroprotectora de los compuestos de prueba contra la EH utilizando modelos establecidos de Caenorhabditis elegans transgénicos poliQ. La cepa AM141 se elige para el ensayo de agregación polyQ ya que un fenotipo asociado a la edad de agregados fluorescentes discretos se puede observar fácilmente en su pared corporal en la etapa adulta debido a la expresión específica del músculo de las proteínas de fusión polyQ::YFP. En contraste, el modelo HA759 con una fuerte expresión de tractos expandidos por polyQ en las neuronas ASH se utiliza para examinar la muerte neuronal y el comportamiento de quimioavoidencia. Para evaluar exhaustivamente la capacidad neuroprotectora de los compuestos objetivo, los resultados de las pruebas anteriores se presentan en última instancia como un gráfico de radar con perfiles de múltiples fenotipos en una forma de comparación directa y visualización directa.
La neurodegeneración progresiva en la EH implica huntingtina mutante patógena con un estiramiento anormal de poliQ codificado por repeticiones de trinucleótidos CAG 1,2,3. Las proteínas huntingtina mutantes con más de 37 repeticiones de glutamina son propensas a agregarse y acumularse en los cerebros de pacientes con EH y modelos animales 4,5, lo que finalmente conduce a la neurodegeneración6. A pesar de la falta de claridad sobre los roles de los agregados de polyQ en la patología de la enfermedad5, la inhibición de la agregación de polyQ y su toxicidad asociada es una estrategia terapéutica útil para la EH y otras enfermedades poliQ 4,7,8.
Debido a la conservación en las vías de señalización neuronal y a los modelos de enfermedades transgénicas fáciles de construir, Caenorhabditis elegans ha sido ampliamente utilizado como un importante organismo modelo para la investigación de trastornos neurológicos 9,10,11,12. Por ejemplo, los modelos transgénicos de C. elegans que expresan expansiones poliQ propensas a la agregación pueden imitar objetivamente características similares a la EH, como la pérdida selectiva de células neuronales, la formación de agregados citoplasmáticos y los defectos de comportamiento13. La investigación de los efectos potenciales de las muestras de prueba para revertir estos fenotipos en modelos de nematodos poliQ establecidos ha llevado a la identificación de una variedad de candidatos terapéuticos prometedores, por ejemplo, polisacáridos 7,14,15, oligosacáridos16, moléculas pequeñas naturales 17,18 y extractos y fórmulas herbales19,20.
Aquí se describen dos modelos principales de polyQ C. elegans y protocolos relevantes para aplicaciones potenciales, como lo ejemplifica el estudio sobre astragalan, un polisacárido aislado de Astragalus membranaceus7. Para el ensayo de agregación de polyQ en C. elegans, el modelo utilizado es la cepa transgénica AM141, que muestra puncta fluorescente dispersa en su músculo de la pared corporal al llegar a la edad adulta debido a la expresión de la proteína de fusión Q40::YFP, un tracto polyQ de 40 residuos (polyQ40) fusionado con proteína fluorescente amarilla (YFP)21,22 . La cepa HA759 se utilizó para examinar la supervivencia neuronal y el comportamiento de quimioavoidencia, ya que expresa tanto la proteína fluorescente verde (GFP) como Htn-Q150 (un tracto poliQ derivado de la huntingtina humana de 150 residuos) fuertemente en las neuronas ASH pero débilmente en otras neuronas, lo que resulta en neurodegeneración progresiva y muerte celular ASH 7,13. Se proporciona un resumen completo del potencial neuroprotector de los candidatos terapéuticos mediante la integración de los resultados de diferentes ensayos.
Como la agregación de polyQ y la proteotoxicidad son características importantes de los trastornos de polyQ, como la enfermedad de Huntington13, recomendamos el uso de múltiples modelos y métodos para evaluar exhaustivamente la capacidad neuroprotectora de los compuestos de prueba, incluido el ensayo de agregación de polyQ en la cepa AM141, el ensayo de supervivencia neuronal ASH en la cepa HA759 y el ensayo de evitación quimiosensorial en la cepa HA759. Los protocolos aquí presentados se han utilizado para evaluar las capacidades neuroprotectoras de las muestras de ensayo frente a la toxicidad del poliQ, incluyendo efectos inhibitorios tanto sobre la agregación del poliQ como sobre la neurotoxicidad asociada 7,14,15,16,17,19,20, demostrando su potencial en el descubrimiento de fármacos para la EH y otras enfermedades poliQ.
Se introduce un sistema automatizado de imágenes y análisis para la detección y el recuento de agregados poliQ en el ensayo de agregación poliQ. Este método tiene las ventajas de ser de alto rendimiento y eficiente en el tiempo y da como resultado errores subjetivos significativamente reducidos en el laborioso proceso de conteo. Para una placa completa de 384 pocillos, solo se necesitan <1 h para finalizar la adquisición y el análisis de la imagen. Sin embargo, el método de imagen microscópica convencional también ha mostrado un rendimiento similar en este laboratorio sin utilizar el dispositivo de imagen automatizado7.
Se recomienda un total de 100-150 nematodos por tratamiento en un ensayo de agregación Q40::YFP típico para cada punto de tiempo, que se puede realizar en pozos replicados que contienen 10-15 nematodos cada uno. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las larvas de L1 pueden ser más sensibles a algunos tratamientos o concentraciones más altas. Por lo tanto, dosis más altas de compuestos de prueba podrían inhibir su crecimiento, lo que lleva a resultados falsos positivos debido al crecimiento lento y, por lo tanto, a la agregación de polyQ retrasada. Por lo general, se puede realizar un ensayo de aclaramiento de alimentos para abordar esta preocupación y garantizar el rango de concentración adecuado de los compuestos de prueba23.
Los nematodos transgénicos HA759 utilizados en los ensayos de neurotoxicidad poliQ coexpresan OSM-10::GFP y Htn-Q150, lo que permite identificar inequívocamente las neuronas sensoriales ASH bilaterales. Por lo tanto, la supervivencia de la neurona ASH se evalúa por la presencia o ausencia de expresión de GFP; por lo general, ~ 40-75% de las neuronas ASH en los nematodos de control están muertas23,24. Curiosamente, el fondo mutante genético pqe-1 (potenciador de poliglutamina-1) en la cepa HA759 (pqe-1; Htn-Q150) acelera la toxicidad mediada por poliQ, lo que lleva a la muerte de la mayoría de las neuronas ASH en tres días, incluso a 15 ° C, y por lo tanto esta cepa se cultiva a 15 ° C para el ensayo de supervivencia neuronal, como se informó anteriormente23,24.
La pérdida funcional de neuronas ASH en nematodos HA759 puede ocurrir antes de la detección de muerte celular y agregados de proteínas13; por lo tanto, el ensayo de comportamiento de evitación osmótica es esencial para la evaluación de la toxicidad mediada por poliQ. Para minimizar el impacto potencial de los nematodos HA759 menos activos a baja temperatura en los experimentos de comportamiento, las placas de ensayo de evitación se incuban en una incubadora humidificada de 23 ° C en lugar de a 15 ° C como en el ensayo de supervivencia neuronal utilizando esta cepa. Además, se ha informado que los nematodos transgénicos Htn-Q150/OSM-10::GFP son altamente sensibles al tacto nasal; por lo tanto, una detección alternativa de la función de la neurona ASH es el ensayo de contacto nasal13.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los ex miembros del Laboratorio Huang que han ayudado a desarrollar y mejorar los protocolos utilizados en este documento, en particular, Hanrui Zhang, Lingyun Xiao y Yanxia Xiang. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto 111 (número de subvención B17018) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hebei (número de subvención H2020207002).
C. elegans strains | |||
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
E. coli strains | |||
NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
Reagent | |||
Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
Equipment | |||
384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress Pico | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
Software | |||
Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |