在这里,我们提出了一个方案来评估 秀丽隐杆线虫中测试化合物的神经保护活性,包括聚谷氨酰胺聚集,神经元死亡和化学避免行为,以及多种表型的示例性整合。
与年龄相关的致病蛋白错误折叠和聚集是导致几种神经退行性疾病的原因。例如,亨廷顿舞蹈症(HD)主要由编码亨廷顿蛋白中膨胀的谷氨酰胺束的CAG核苷酸重复序列驱动。因此,抑制聚谷氨酰胺(polyQ)聚集,特别是聚集相关的神经毒性是预防HD和其他多Q相关疾病的有用策略。本文介绍了使用已建立的polyQ转基因 秀丽隐杆线虫模型 评估测试化合物对HD的神经保护能力的广义实验方案。AM141菌株被选择用于polyQ聚集测定,因为由于polyQ::YFP融合蛋白的肌肉特异性表达,可以在成年期在其体壁上轻松观察到离散荧光聚集体的年龄相关表型。相比之下,在ASH神经元中具有强烈表达的polyQ扩增束的HA759模型用于检查神经元死亡和化学避免行为。为了全面评估目标化合物的神经保护能力,最终将上述测试结果以雷达图的形式呈现,以直接比较和直接观察的方式对多种表型进行剖析。
亨廷顿舞蹈症的进行性神经退行性变涉及致病性突变亨廷顿蛋白,其多Q由CAG三核苷酸重复序列1,2,3编码。具有超过37个谷氨酰胺重复序列的突变亨廷顿蛋白容易在HD患者和动物模型4,5的大脑中聚集和积累,最终导致神经变性6。尽管polyQ聚集体在疾病病理学中的作用缺乏明确性5,但抑制polyQ聚集及其相关毒性是HD和其他多Q疾病的有用治疗策略4,7,8。
由于神经元信号通路的保存和易于构建的转基因疾病模型, 秀丽隐杆线虫 已被广泛用作研究神经系统疾病的主要模式生物9,10,11,12。例如,表达易聚集性polyQ扩增 的转基因秀丽隐杆线虫 模型可以客观地模拟HD样特征,例如选择性神经元细胞丢失,细胞质聚集体形成和行为缺陷13。对测试样品在已建立的polyQ线虫模型中逆转这些表型的潜在影响的研究导致鉴定出各种有希望的治疗候选物,例如多糖7,14,15,寡糖16,天然小分子17,18和草药提取物和配方19,20。
这里描述了两个主要的polyQ C. 秀丽隐杆线虫 模型和潜在应用的相关方案,例如黄芪,一种从黄 芪7中分离出来的多糖。对于 秀丽隐杆线虫的 polyQ 聚集测定,使用的模型是转基因菌株 AM141,其显示由于 Q40::YFP 融合蛋白(40 个残基的多Q 束)的表达而在到达成年期时,荧光点分散在其体壁肌肉中,Q40 残基 (polyQ40) 融合到黄色荧光蛋白 (YFP)21,22.菌株HA759用于检查神经元存活和化学避免行为,因为它在ASH神经元中强烈表达绿色荧光蛋白(GFP)和Htn-Q150(人亨廷顿蛋白衍生的150个残基的polyQ束),但在其他神经元中表达较弱,导致进行性神经变性和ASH细胞死亡7,13。通过整合不同测定的结果,提供了治疗候选药物的神经保护潜力的全面摘要。
由于polyQ聚集和蛋白毒性是多Q疾病(如亨廷顿舞蹈症13)的重要特征,我们建议使用多种模型和方法来全面评估测试化合物的神经保护能力,包括AM141菌株中的polyQ聚集测定,HA759菌株中的ASH神经元存活测定和HA759菌株中的化学感觉回避测定。这里介绍的方案已被用于评估测试样品对polyQ毒性的神经保护能力,包括对polyQ聚集和相关神经毒性的抑制作用7,14,15,16,17,19,20,证明了它们在HD和其他polyQ疾病的药物发现方面的潜力。
引入了自动成像和分析系统,用于检测和计数 polyQ 聚集体测定中的 polyQ 聚集体。该方法具有高通量和省时的优点,可显著减少费力计数过程中的主观误差。对于整个384孔板,只需<1小时即可完成图像采集和分析。然而,传统的显微成像方法在不使用自动成像装置7的情况下也显示出类似的性能。
在每个时间点的典型Q40::YFP聚集测定中,建议每次处理总共100-150个线虫,这可以在每个包含10-15个线虫的重复孔中进行。然而,应该注意的是,L1幼虫可能对某些治疗或更高浓度更敏感。因此,较高剂量的测试化合物可能会抑制其生长,导致由于生长缓慢而导致的假阳性结果,从而延迟polyQ聚集。通常,可以进行食品清除测定以解决这一问题并确保测试化合物23的适当浓度范围。
用于polyQ神经毒性测定的HA759转基因线虫共同表达OSM-10::GFP和Htn-Q150,从而可以明确地识别双侧ASH感觉神经元。因此,ASH神经元的存活率通过GFP表达的存在与否来评估;通常,对照线虫中约40-75%的ASH神经元死亡23,24。有趣的是,HA759菌株中的 pqe-1 (聚谷氨酰胺增强子-1)遗传突变体背景(pqe-1;Htn-Q150)加速polyQ介导的毒性,导致大多数ASH神经元在三天内死亡,即使在15°C下也是如此,因此该菌株在15°C下生长用于神经元存活测定,如前所述23,24。
HA759线虫中ASH神经元的功能丧失可能发生在细胞死亡和蛋白质聚集体13的检测之前;因此,渗透性避免行为测定对于评估 polyQ 介导的毒性至关重要。为了最大限度地减少低温下活性较低的HA759线虫对行为实验的潜在影响,将避免测定板在加湿的23°C培养箱中孵育,而不是在15°C下孵育,如使用该菌株的神经元存活测定。此外,据报道,Htn-Q150/OSM-10::GFP转基因线虫对鼻子触摸高度敏感;因此,ASH神经元功能的另一种检测是鼻子触摸测定13。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢黄实验室的前成员,他们帮助开发和改进了本文中使用的协议,特别是张寒锐,肖凌云和燕霞翔。本研究由111工程(资助号B17018)和河北省自然科学基金(资助号H2020207002)资助。
C. elegans strains | |||
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
E. coli strains | |||
NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
Reagent | |||
Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
Equipment | |||
384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress Pico | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
Software | |||
Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |