Здесь мы представляем протокол для оценки нейропротекторной активности тестовых соединений в Caenorhabditis elegans, включая агрегацию полиглутамина, гибель нейронов и поведение химиообнаружения, а также образцовую интеграцию нескольких фенотипов.
Возрастное неправильное сворачивание и агрегация патогенных белков ответственны за несколько нейродегенеративных заболеваний. Например, болезнь Гентингтона (БГ) в основном обусловлена ЦАГ-нуклеотидным повтором, который кодирует расширенный глютаминовый тракт в белке гентингтина. Таким образом, ингибирование агрегации полиглутамина (polyQ) и, в частности, агрегационно-ассоциированной нейротоксичности является полезной стратегией профилактики БГ и других полиQ-ассоциированных состояний. В данной работе представлены обобщенные экспериментальные протоколы для оценки нейропротекторной способности тестовых соединений против БГ с использованием установленных моделей polyQ transgenic Caenorhabditis elegans . Штамм AM141 выбран для анализа агрегации polyQ, поскольку возрастной фенотип дискретных флуоресцентных агрегатов можно легко наблюдать в стенке его тела на взрослой стадии из-за мышечной экспрессии белков слияния polyQ::YFP. Напротив, модель HA759 с сильной экспрессией полиQ-расширенных трактов в нейронах ASH используется для изучения гибели нейронов и поведения химиопопущения. Для всесторонней оценки нейропротекторной способности целевых соединений приведенные выше результаты испытаний в конечном итоге представляются в виде радиолокационной диаграммы с профилированием нескольких фенотипов способом прямого сравнения и прямого просмотра.
Прогрессирующая нейродегенерация при БГ включает патогенный мутантный гентингтин с аномальным растяжением polyQ, кодируемым CAG тринуклеотидными повторами 1,2,3. Мутантные белки гентингтина с более чем 37 повторами глутамина склонны к агрегированию и накоплению в мозге пациентов с БГ и животных моделей 4,5, что в конечном итоге приводит к нейродегенерации6. Несмотря на отсутствие ясности в отношении роли агрегатов polyQ в патологии заболевания5, ингибирование агрегации polyQ и связанной с ней токсичности является полезной терапевтической стратегией для БГ и других заболеваний polyQ 4,7,8.
Благодаря сохранению в нейронных сигнальных путях и простых в построении трансгенных моделей заболеваний, Caenorhabditis elegans широко используется в качестве основного модельного организма для исследования неврологических расстройств 9,10,11,12. Например, трансгенные модели C. elegans, экспрессирующие склонные к агрегации расширения polyQ, могут объективно имитировать HD-подобные особенности, такие как селективная потеря нейронных клеток, формирование цитоплазматического агрегата и поведенческие дефекты13. Исследование потенциальных эффектов тестовых образцов для обращения вспять этих фенотипов в установленных моделях нематод polyQ привело к идентификации различных перспективных терапевтических кандидатов, например, полисахаридов 7,14,15, олигосахаридов16, природных малых молекул17,18 и растительных экстрактов и формул19,20.
Здесь описаны две основные модели polyQ C. elegans и соответствующие протоколы для потенциальных применений, примером которых является исследование астрагалана, полисахарида, выделенного из Astragalus membranaceus7. Для анализа агрегации polyQ у C. elegans используется трансгенный штамм AM141, который показывает флуоресцентную пункту, диспергированную в мышце стенки тела при достижении зрелого возраста из-за экспрессии белка слияния Q40::YFP, тракта polyQ из 40 остатков (polyQ40), слитого с желтым флуоресцентным белком (YFP)21,22 . Штамм HA759 был использован для изучения выживаемости нейронов и хемоэкономического поведения, поскольку он экспрессирует как зеленый флуоресцентный белок (GFP), так и Htn-Q150 (человеческий гентингтиновый тракт polyQ из 150 остатков) сильно в нейронах ASH, но слабо в других нейронах, что приводит к прогрессирующей нейродегенерации и гибели клеток ASH 7,13. Всестороннее резюме нейропротекторного потенциала терапевтических кандидатов обеспечивается путем интеграции результатов различных анализов.
Поскольку агрегация polyQ и протеотоксичность являются важными особенностями расстройств polyQ, таких как болезнь Гентингтона13, мы рекомендуем использовать несколько моделей и методов для всесторонней оценки нейропротекторной способности тестовых соединений, включая анализ агрегации polyQ в штамме AM141, анализ выживания нейронов ASH в штамме HA759 и анализ хемосенсорного избегания в штамме HA759. Представленные здесь протоколы были использованы для оценки нейропротекторной способности тестовых образцов против токсичности polyQ, включая ингибирующее воздействие как на агрегацию polyQ, так и на связанную нейротоксичность 7,14,15,16,17,19,20, демонстрируя их потенциал в открытии лекарств для БГ и других заболеваний polyQ.
Внедрена автоматизированная система визуализации и анализа для обнаружения и подсчета агрегатов polyQ в агрегационном анализе polyQ. Этот метод имеет преимущества в том, что он является высокопроизводительным и эффективным по времени и приводит к значительному снижению субъективных ошибок в трудоемком процессе подсчета. Для всей пластины из 384 скважин требуется всего <1 ч, чтобы завершить получение и анализ изображения. Однако обычный метод микроскопической визуализации также показал аналогичную производительность в этой лаборатории без использования автоматизированного устройства визуализации7.
В общей сложности 100-150 нематод за обработку рекомендуются в типичном анализе агрегации Q40: YFP для каждой точки времени, который может быть выполнен в реплицированных лунках, содержащих 10-15 нематод каждая. Однако следует отметить, что личинки L1 могут быть более чувствительными к некоторым обработкам или более высоким концентрациям. Поэтому более высокие дозы тестовых соединений могут ингибировать их рост, что приводит к ложноположительным результатам из-за медленного роста и, таким образом, задержки агрегации polyQ. Обычно для решения этой проблемы и обеспечения соответствующего диапазона концентраций исследуемых соединений23 может быть выполнен анализ пищевого клиренса.
Трансгенные нематоды HA759, используемые в анализах нейротоксичности polyQ, совместно экспрессируют OSM-10::GFP и Htn-Q150, что позволяет однозначно идентифицировать двусторонние сенсорные нейроны ASH. Следовательно, выживаемость нейронов ASH оценивается по наличию или отсутствию экспрессии GFP; Обычно ~ 40-75% нейронов ASH в контрольных нематодах мертвы23,24. Интересно, что генетический мутантный фон pqe-1 (усилитель полиглутамина-1) в штамме HA759 (pqe-1; Htn-Q150) ускоряет полиQ-опосредованную токсичность, приводя к гибели большинства нейронов ASH в течение трех дней, даже при 15 °C, и поэтому этот штамм выращивается при 15 °C для анализа выживания нейронов, как сообщалось ранее23,24.
Функциональная потеря нейронов ASH у нематод HA759 может произойти до обнаружения гибели клеток и белковых агрегатов13; поэтому осмотический анализ поведения избегания имеет важное значение для оценки токсичности, опосредованной полиQ. Чтобы свести к минимуму потенциальное влияние менее активных нематод HA759 при низкой температуре на поведенческие эксперименты, пластины для анализа избегания инкубируют в увлажненном инкубаторе с температурой 23 ° C, а не при 15 ° C, как в анализе выживания нейронов с использованием этого штамма. Кроме того, сообщалось, что трансгенные нематоды Htn-Q150/OSM-10::GFP очень чувствительны к прикосновению носа; следовательно, альтернативным обнаружением функции нейрона ASH является анализ прикосновения кносу 13.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим бывших членов Лаборатории Хуан, которые помогли разработать и улучшить протоколы, используемые в этой статье, в частности, Ханруй Чжан, Линъюнь Сяо и Янься Сян. Эта работа была поддержана проектом 111 (номер гранта B17018) и Фондом естественных наук провинции Хэбэй (номер гранта H2020207002).
C. elegans strains | |||
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
E. coli strains | |||
NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
Reagent | |||
Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
Equipment | |||
384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress Pico | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
Software | |||
Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |