여기에서, 우리는 폴리글루타민 응집, 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동뿐만 아니라 다중 표현형의 예시적인 통합을 포함하는 예쁜꼬마선충에서 시험 화합물의 신경 보호 활성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시한다.
연령과 관련된 병원성 단백질의 미스폴딩 및 응집은 여러 신경 퇴행성 질환에 책임이 있습니다. 예를 들어, 헌팅턴병(HD)은 주로 헌팅틴 단백질에서 확장된 글루타민 관을 인코딩하는 CAG 뉴클레오티드 반복에 의해 유발된다. 따라서, 폴리글루타민(polyQ) 응집의 억제 및, 특히 응집-관련 신경독성은 HD 및 다른 폴리Q 관련 상태의 예방을 위한 유용한 전략이다. 이 논문은 확립 된 polyQ 트랜스제닉 Caenorhabditis elegans 모델을 사용하여 HD 에 대한 테스트 화합물의 신경 보호 능력을 평가하기위한 일반화 된 실험 프로토콜을 소개합니다. AM141 균주는 polyQ::YFP 융합 단백질의 근육 특이적 발현으로 인해 성인 단계에서 그의 체벽에서 쉽게 관찰될 수 있는 분리된 형광 응집체의 연령 관련 표현형으로서 polyQ 응집 분석을 위해 선택된다. 대조적으로, ASH 뉴런에서 polyQ-expanded tracts의 강한 발현을 갖는 HA759 모델은 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동을 검사하는데 사용된다. 표적 화합물의 신경 보호 능력을 종합적으로 평가하기 위해, 상기 시험 결과는 궁극적으로 직접 비교 및 직접 관찰의 방식으로 여러 표현형의 프로파일 링과 레이더 차트로 제시됩니다.
HD에서의 진행성 신경변성은 CAG 트리뉴클레오타이드 반복 1,2,3에 의해 코딩되는 폴리Q의 비정상적인 스트레치를 갖는 병원성 돌연변이 헌팅틴을 수반한다. 37개 이상의 글루타민 반복을 갖는 돌연변이 헌팅틴 단백질은 헌팅턴병 환자와 동물 모델4,5의 뇌에 응집되어 축적되기 쉬우며, 이는 궁극적으로 신경변성6을 유도한다. 질병 병리학5에서 polyQ 응집체의 역할에 대한 명확성이 부족함에도 불구하고, 폴리Q 응집 및 그의 관련 독성의 억제는 HD 및 다른 폴리Q 질환4,7,8에 유용한 치료 전략이다.
신경 신호 전달 경로의 보존과 구축하기 쉬운 트랜스제닉 질환 모델로 인해, 예쁜꼬마선충은 신경 장애9,10,11,12의 조사를 위한 주요 모델 유기체로서 널리 이용되고 있다. 예를 들어, 응집되기 쉬운 폴리Q 확장을 발현하는 트랜스제닉 C. 엘레간 모델은 선택적 뉴런 세포 손실, 세포질 응집체 형성, 및 행동 결함(13)과 같은 HD 유사 특징을 객관적으로 모방할 수 있다. 확립된 폴리Q 선충류 모델에서 이러한 표현형을 역전시키는 시험 샘플의 잠재적 효과에 대한 조사는 다양한 유망한 치료 후보, 예를 들어, 다당류7,14,15, 올리고당 16, 천연 소분자 17,18, 및 생약 추출물 및 수식 19,20의 동정을 이끌었다.
여기에 설명된 두 가지 주요 polyQ C. elegans 모델 및 Astragalus membranaceus7로부터 분리된 다당류인 아스트라갈란에 대한 연구에 의해 예시된 바와 같은 잠재적 응용을 위한 관련 프로토콜이 기술되어 있다. C. elegans에서의 polyQ 응집 분석의 경우, 사용된 모델은 Q40:YFP 융합 단백질의 발현으로 인해 성인기에 도달했을 때 체벽 근육에 분산된 형광 펑타를 보여주는 트랜스제닉 균주 AM141입니다:YFP 융합 단백질, 노란색 형광 단백질(YFP)21,22에 융합된 40개의 잔기(polyQ40)의 폴리Q 관 . HA759 균주는 ASH 뉴런에서는 녹색 형광 단백질(GFP)과 Htn-Q150(인간 헌팅틴 유래 폴리Q 관(150개 잔기의 인간 헌팅틴 유래 폴리Q 관)을 모두 발현하지만 다른 뉴런에서는 약하게 발현하여 진행성 신경변성 및 ASH 세포 사멸 7,13을 초래함에 따라 뉴런 생존 및 화학회피 거동을 검사하는데 사용되었다. 치료 후보물질의 신경 보호 잠재력에 대한 포괄적인 요약은 상이한 분석으로부터의 결과를 통합함으로써 제공된다.
polyQ 응집 및 단백질 독성은 헌팅턴병13과 같은 polyQ 장애의 중요한 특징이므로, AM141 균주의 polyQ 응집 분석, HA759 균주에서의 ASH 뉴런 생존 분석, HA759 균주에서의 화학감각 회피 검정을 포함하는 시험 화합물의 신경 보호 능력을 종합적으로 평가하기 위해 여러 모델 및 방법의 사용을 권장합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 polyQ 응집 및 관련 신경 독성 7,14,15,16,17,19,20에 대한 억제 효과를 포함하여 polyQ 독성에 대한 테스트 샘플의 신경 보호 능력을 평가하는 데 사용되어 HD 및 기타 polyQ 질환에 대한 약물 발견에서의 잠재력을 입증합니다.
자동화된 이미징 및 분석 시스템이 polyQ 응집체 분석에서 폴리Q 응집체의 검출 및 계수를 위해 도입된다. 이 방법은 높은 처리량과 시간 효율적이라는 장점이 있으며 까다로운 계산 프로세스에서 주관적인 오류를 크게 줄입니다. 전체 384웰 플레이트의 경우 이미지 수집 및 분석을 완료하는 데 <1시간 밖에 걸리지 않습니다. 그러나, 종래의 현미경 영상화 방법도 자동화 영상화 장치(7)를 사용하지 않고 이 실험실에서 유사한 성능을 나타내었다.
치료 당 총 100-150 선충류는 각 시점마다 전형적인 Q40::YFP 응집 분석에서 권장되며, 이는 각각 10-15 개의 선충류를 함유 한 복제 웰에서 수행 할 수 있습니다. 그러나 L1 유충은 일부 치료 또는 더 높은 농도에 더 민감 할 수 있습니다. 따라서, 시험 화합물의 더 높은 투여량은 그들의 성장을 억제할 수 있고, 느린 성장으로 인한 위양성 결과를 초래할 수 있고, 따라서, 지연된 polyQ 응집으로 인해. 보통, 식품 클리어런스 분석은 이러한 우려를 해결하고 시험 화합물23의 적절한 농도 범위를 보장하기 위해 수행될 수 있다.
polyQ 신경독성 분석에 사용되는 HA759 형질전환 선충류는 OSM-10::GFP 및 Htn-Q150을 공동 발현하므로 양측 ASH 감각 뉴런을 명확하게 식별할 수 있습니다. 따라서, ASH 뉴런 생존은 GFP 발현의 존재 또는 부재에 의해 평가되고; 일반적으로 통제 선충류의 ASH 뉴런의 ~ 40-75 %는23,24 명이 사망했습니다. 흥미롭게도, HA759 균주에서 pqe-1(폴리글루타민 인핸서-1) 유전적 돌연변이 배경(pqe-1; Htn-Q150)은 polyQ 매개 독성을 가속화하여 15°C에서도 3일 이내에 대부분의 ASH 뉴런의 사멸을 유도하며, 따라서 이 균주는 이전에 보고된23,24와 같이 뉴런 생존 분석을 위해 15°C에서 성장한다.
HA759 선충류에서 ASH 뉴런의 기능적 손실은 세포 사멸 및 단백질 응집체의 검출 전에 발생할 수 있다13; 따라서, 삼투압 회피 거동 분석은 폴리Q 매개 독성의 평가에 필수적이다. 저온에서 덜 활성인 HA759 선충류가 행동 실험에 미치는 잠재적 영향을 최소화하기 위해, 회피 분석 플레이트는 이 균주를 사용하는 뉴런 생존 분석에서와 같이 15°C에서가 아니라 가습된 23°C 인큐베이터에서 인큐베이션된다. 또한, Htn-Q150/OSM-10::GFP 형질전환 선충류는 코 접촉에 매우 민감하다는 것이 보고되었다; 따라서, ASH 뉴런 기능의 대안적인 검출은 코 터치 분석(13)이다.
The authors have nothing to disclose.
우리는이 논문에 사용 된 프로토콜을 개발하고 개선하는 데 도움을 준 Huang Lab의 전 회원, 특히 Hanrui Zhang, Lingyun Xiao 및 Yanxia Xiang에게 감사드립니다. 이 작업은 111 프로젝트 (보조금 번호 B17018)와 허베이 성 자연 과학 재단 (보조금 번호 H2020207002)의 지원을 받았습니다.
C. elegans strains | |||
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
E. coli strains | |||
NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
Reagent | |||
Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
Equipment | |||
384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress Pico | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
Software | |||
Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |