秀丽隐杆线虫 作为发现生物活性化合物对抗聚谷氨酰胺介导的神经毒性的模型系统

注意：有关该协议中使用的溶液配方，请参见 表1 。 1. 秀 丽隐杆线虫 测定材料的制备 秀丽隐杆线虫菌株的维持 获得 秀丽隐杆线虫 （AM141和HA759）和 大肠杆菌 （OP50和NA22）菌株（参见 材料表）。 将接种有 大肠杆菌 OP50的线虫生长培养基（NGM）板上的线虫维持在20°C AM14121 或15°C用于HA75923。 大肠杆菌OP50细菌培养物的制备 从卢里亚-贝塔尼（LB）条纹板中挑选一批 大肠杆菌 OP50，并将其接种到50 mL液体LB培养物中。 将OP50细菌在37°C和200rpm的振荡器中孵育，直到在570nm（OD570）处的光密度为〜0.5。 将OP50细菌培养物储存在4°C，并在两周内使用。 使用OP50细菌制备NGM板 将20克琼脂，2.5克蛋白胨，3.0克NaCl和975毫升去离子水加入1升可高压灭菌的瓶子中。在121°C高压灭菌30分钟。 将液体NGM琼脂瓶放在工作台上冷却至〜60°C，然后加入以下无菌储备溶液：1 mL 1 M CaCl2，1 mL 1 mL 1 mMGSO4，1 mL 5mg / mL胆固醇和25 mL 1M磷酸钾（pH 6.0）。 将20 mL NGM倒入无菌的90毫米培养皿中，并将板放在工作台上冷却和凝固。将盘子倒置，让它们在室温下在工作台上干燥2天。 将200μLOP50细菌培养物分配到每个NGM板上，并用无菌玻璃涂层棒均匀分布。合上盖子并将板在37°C下孵育过夜。 将接种有OP50的NGM板存放在带有盖子的塑料盒中，并在室温下使用。 年龄同步 秀丽隐杆线虫种群的 制备 将重力成线虫收集到无菌的1.5mL微量离心管中，并以1000× g 离心1分钟。洗涤三次，并将线虫重悬于M9缓冲液中。 加入等体积的漂白剂溶液，轻轻搅拌3-5分钟。在解剖显微镜下每15秒监测一次漂白。注意：漂白剂溶液必须在使用前通过混合等体积的10%NaOCl和1 M NaOH新鲜制备（表1）20。 一旦大多数线虫被破坏，通过用M9缓冲液稀释来停止消化。快速离心除去上清液，并将沉淀重悬于M9缓冲液中，重复洗涤三次。 将沉淀重悬于S培养基中。让线虫残渣通过重力沉降2-3分钟，而卵子保留在上清液中。 将上清液吸入新的无菌微量离心管中。通过以1000× g 离心1分钟收集卵子。 弃去约80%的上清液，并将卵子转移到含有20 mL S培养基的无菌烧瓶中。将烧瓶放入摇摇杯中，在没有食物的情况下以120rpm的速度孵育卵过夜，以获得同步的L1线虫。 2. 聚Q聚集测定 用于 polyQ 聚集测定的线虫的制备 将AM141的300-500个同步L1幼虫转移到48孔板的每个孔中，其中500μL含有OP50（OD570 为0.7-0.8）和5mg / mL黄芪，通常每次处理一个孔，持续一个时间点。 用石蜡膜密封板，并在20°C和120rpm下孵育24，48，72和96小时。 在无菌的1.5mL微量离心管中收获线虫，并用M9缓冲液>3次离心（1000× g1 分钟）洗涤以除去剩余的OP50。将AM141线虫重悬于M9缓冲液中，并准备好进行图像采集。 荧光图像采集和数据分析注意：使用此高内涵成像系统自动分析数据。如果没有自动成像设备，可以使用常规方法制备琼脂糖垫进行图像采集，通过使用普通荧光显微镜7，15，17来实现类似的性能（参见步骤3.2和3.3）。 将10-15个线虫转移到384孔板中的每个孔中（最终体积为每孔80μL）。每次处理设置10个重复孔。 向每个孔中加入10μL200mM叠氮化钠以麻痹线虫并使其沉降到底部（5-10分钟）。 将板置于高内涵成像系统中以获取荧光图像（有关设备和软件信息，请参见 材料表 ）。 打开图像采集软件并设置以下参数。 打开“ 板采集设置” 窗口，创建新的实验集和名称。 选择“ 放大倍率 ”为 2x，选择 “相机合并 ”为 1，选择 “板类型” 为 “384 孔板”。 设置要访问的井和站点（单个站点）。 选择荧光素异硫氰酸酯（FITC）滤光片 并启用基于图像的对焦选项。 将 曝光 设置为 300 毫秒。注：可以测试和调整上述设置，以优化成像参数。 保存 图像采集 设置，然后单击“ 采集板 ”按钮运行。 使用图像分析软件分析图像数据。 打开“ 检查板数据 ”窗口，然后选择用于图像分析的 “测试印版 ”。 双击测试井以显示其图像。 选择 “计数核” 作为分析方法，然后单击 “配置设置” 按钮以显示以下设置的窗口。 定义 FITC 通道中的源图像，然后选择 标准算法。 按如下方式设置图像分析参数：近似最小宽度= 10μm（= 2像素）;近似最大宽度 = 50 μm （= 12 像素）;高于局部背景的强度 = 1，000-2，000 灰度。 测试当前设置以优化分析方法。 保存设置并对所有孔运行分析。注意：完成一个384孔板的分析需要约20分钟。 将 总核 导出为每个孔中Q40：：YFP聚集的总数。 计算每个孔中线虫的数量。 计算每组中每条线虫 Q40：：YFP 聚合的平均数，并对每个时间点的数据应用非线性曲线拟合。 使用以下等式 （1） 计算抑制指数：抑制指数 = （1）其中N个对照 组和N个样本 分别是对照组和处理组Q40：：YFP聚集的平均数。 3. PolyQ 介导的神经毒性检测 用测试样品处理秀丽隐杆线虫 为了制备用于polyQ神经毒性测定的线虫，将HA759的300-500个同步L1幼虫转移到48孔板的每个孔中，其中500μL S培养基含有OP50（OD570 的0.7-0.8）和5mg / mL黄芪，通常每次处理有三个重复孔。 用石蜡膜密封板，并在15°C和120rpm下孵育3天23。 离心收集线虫，用M9缓冲液洗涤3-5次。将线虫重悬于M9缓冲液中，用于神经元存活和回避测定。 琼脂糖垫的制备 将2g琼脂糖加入100 mL M9缓冲液（2%，w / v）中，并在微波炉中将琼脂糖溶液加热至接近沸腾。 将0.5 mL熔化的琼脂糖分配到放置在两块2 mm厚玻璃板之间的1 mm厚显微镜载玻片的中心。用另一张幻灯片垂直覆盖。琼脂糖冷却并凝固后，轻轻取下顶部滑块。 ASH神经元存活试验 在琼脂糖垫上加入一滴20mM叠氮化钠。将15-20个HA759线虫转移到液滴中以固定它们。 将盖玻片轻轻地放在线虫上。将载玻片保存在装有数码相机的荧光显微镜下。选择40倍物镜和FITC滤光片以检测线虫头部区域的GFP阳性ASH神经元。 在每组中随机选择50个以上的线虫，以计算在其头部区域具有GFP标记的双侧ASH神经元的线虫数量7。使用下面的等式（2）计算ASH神经元的存活率。神经元存活率 （%） = （2）其中N存活 率和N总数 分别是具有GFP阳性ASH神经元的线虫数量和每组中测试线虫的总数。 渗透性避免试验 将不含食物的NGM板（9厘米）分成正常（N）和陷阱（T）区域，中间有一条8M甘油（~30μL）线。将200mM叠氮化钠（〜20μL）线铺展在距离甘油线约1厘米处，以麻痹穿过甘油屏障进入T区的线虫。 将~200个线虫转移到每组三个重复板的N区。将1%丁二酮（~2μL）滴入T区（距离板边缘1厘米）以吸引线虫。立即盖上培养皿的盖子，并在23°C下孵育90分钟。 在显微镜下对N区和T区的线虫数量进行评分。使用等式 （3）20 计算回避指数。回避指数 = （3）其中 N 和 T 分别是 N 区和 T 区中的线虫数量。数据以三个重复的标准差（SD）±均值表示，代表>3独立实验。 执行不成对的双尾 t 检验，以比较来自黄芪组和对照组的数据。 4. 创建雷达图 打开绘图软件，将不同测定的数据导入新工作表。输入 A（X） 列作为径向轴的标题，输入 A（Y） 列作为对照组的数据，输入 B（Y） 列作为治疗组的数据。 选择所需的数据，然后单击“ 绘图|专用： 工具栏菜单中的雷达按钮，用于生成雷达图。 双击径向轴，然后根据需要调整每个轴的 “刻度”、“刻度”和 “刻度”标签 。 单击菜单中的 “文件 ”，然后选择“ 导出图形 ”以将图像另存为 *.tiff。注：材料 表中 的软件网站提供了有关创建雷达图的详细帮助文档和视频教程。