免疫肽组学：分离小鼠和人MHC I类和II类相关肽用于质谱分析

此处提供的协议改编自已建立的协议13，14，15，16，17，18，19，20。MHC I类和II类肽的免疫亲和纯化（IP）的总体程序 如图1所示。有关所用细胞系和抗体的详细信息，请参见 材料表 。 1. 磁珠与抗体偶联（第1天）：将抗体偶联至琼脂糖CNBr活化微球 注意：为每个新实验准备新的溶液。有关试剂和溶液配方的列表，请参阅材料表和补充表1。所有步骤均在室温（RT）下进行。使用新抗体时，通过收集关键等分试样（参见适应症可选）并进行考马斯蓝染色SDS-PAGE来检查结合效率（图2）。 活化琼脂糖 CNBr 珠 每个样品称量80mg琼脂糖CNBr活化珠，并将其转移到15mL锥形管中。 为了便于重悬干燥的磁珠，首先，加入5毫升1mM HCl，并上下移液5次。然后，用额外的8.5 mL 1 mM HCl填充锥形管。 使用旋转器装置在室温下以20 rpm（每分钟转数）旋转30分钟。在室温下以200× g 离心珠子2分钟，并通过抽吸除去上清液。 向微珠沉淀中加入500μL偶联缓冲液，并转移到新的2.0mL离心管中，并留待步骤1.2.2。 抗体与CNBr活化微球的偶联 通过添加2mg抗体（根据制造商指定的浓度），在新的2.0 mL微量离心管中制备选择用于分离MHC I类或II类肽的抗体。用偶联缓冲液完成体积至1mL，以获得2mg / mL的最终浓度。 在室温下以200× g 离心步骤1.1.4中的珠子2分钟，然后通过抽吸除去上清液。 将抗体溶液加入含有活化微珠的2.0 mL微量离心管中。 （可选）取18μL（INPUT）等分试样，加入6μL4x SDS-PAGE缓冲液，并立即冷冻。 使用旋转器装置将微量离心管从步骤1.2.3以20rpm旋转120分钟。将珠子以200× g 离心2分钟，然后除去上清液。 （可选）取18μL上清液（未结合抗体）的等分试样，加入6μL4x SDS-PAGE缓冲液并立即冷冻。 阻断和洗涤抗体偶联微球 将1mL0.2M甘氨酸加入含有步骤1.2.5中抗体偶联微球的微量离心管中。使用旋转器装置在室温下以20 rpm旋转60分钟。 将珠子以200× g 离心2分钟，然后除去上清液。加入1毫升PBS（磷酸盐缓冲盐水）。 将珠子以200× g 离心2分钟，然后除去上清液。 （可选）取18μL上清液的等分试样（未结合的抗体，最后一次洗涤），加入6μL4x SDS-PAGE缓冲液并立即冷冻。 在步骤1.3.3中将1 mL PBS加入珠中。 （可选）取等分试样18μL微球混合物（微球与抗体偶联），加入6μL4x SDS-PAGE缓冲液，并立即冷冻。 保持在4°C，直到在步骤2.5的同一天使用。注意：磁珠可以在免疫捕获前一天制备，但尚未测试更长的储存时间。 2. 抗体偶联珠细胞裂解和免疫捕获（第1天） 注意：MHC分子的水平因细胞类型而异，建议对每个细胞的MHC / HLA分子进行定量21（图4A）。我们建议每个 IP 至少使用 1 x 108 个电池。该细胞数对应于来自JY，EL4和A20细胞的6-10mg蛋白质，用0.5%Chaps缓冲液溶解。为了制备用于IP的细胞沉淀，应收获细胞，离心并用5mL PBS洗涤两次。然后，细胞沉淀可以储存在-80°C的1.5mL微量离心管或15mL锥形管中，直到IP的时间。请注意，IP可以在新鲜收获或冷冻的细胞颗粒上进行。 为了分离MHC I类或II类肽，通过用手掌加热管的底部来解冻1×10 8 个细胞的冷冻沉淀。向沉淀中加入500μLPBS，并上下移液，直到悬浮液均匀。注意：根据细胞类型，细胞沉淀体积可能会有很大差异。如果500μLPBS不足以溶解细胞沉淀，则使用更多的PBS，直到细胞在上下移液时容易分解。 测量重悬于PBS中的沉淀的总体积，并转移到新的管2mL微量离心管中。如果需要，分成更多管子。 加入一体积的细胞裂解缓冲液（1%chaps缓冲液在含有蛋白酶抑制剂的PBS中，1沉淀/ 10mL缓冲液）相当于前一步中测量的PBS中重悬的细胞沉淀的体积。裂解缓冲液的最终浓度为0.5%Chaps。 使用旋转器装置在4°C下以10rpm旋转60分钟。在4°C下以18，000× g 离心细胞裂解物20分钟，并完全制动，并将上清液（含有MHC肽复合物）转移到新的2.0mL微量离心管中。 通过以200× g 离心2分钟并从步骤1.3.7中回收抗体偶联微球并除去上清液。 将步骤2.4中的细胞裂解物上清液转移到抗体偶联的磁珠中，并使用旋转装置在4°C下旋转（10rpm）孵育14-18小时（过夜）。 3. MHC肽的洗脱（第2天） 注意：聚丙烯色谱柱允许洗脱MHC肽复合物，同时将微珠保留到色谱柱中。为了评估在用1%TFA（三氟乙酸）酸性洗脱之前和之后与珠子结合的MHC肽复合物的比例，可以在方案期间的关键步骤处使用等分试样进行蛋白质印迹（参见适应症可选）。 图3 所示的蛋白质印迹显示，在酸性洗脱1%TFA后，MHC肽复合物的富集。该分数中缺少信号将表明洗脱步骤不成功。请注意，未结合的MHC肽复合物与磁珠的比例也可以通过使用步骤3.1.6中描述的等分试样的蛋白质印迹来并行评估。 从抗体偶联珠中洗脱MHC肽复合物 取下聚丙烯柱的底盖，将柱子放在聚丙烯柱架上，并在下方安装一个空容器以收集流经的流量。注意：每个样品需要一个色谱柱。 用10 mL缓冲液A冲洗聚丙烯色谱柱，并通过重力将其排出。如果液体洗脱的流速太慢，进一步切割聚丙烯柱的底端。 测量并收集步骤2.5中的珠裂解物混合物（〜2mL），并将其转移到聚丙烯柱中。 （可选）取20μL（或总体积的1/100）等分试样进行蛋白质印迹并立即冷冻。该部分对应于与磁珠一起孵育的总MHC肽复合物。 让液体混合物通过重力洗脱。 （可选）收集并测量流出物，取20μL等分试样（或总体积的1/100）进行蛋白质印迹并立即冷冻。该部分代表残留的未结合MHC肽复合物。 为了尽可能多地回收微珠 – 裂解物混合物，请用1mL缓冲液A冲洗步骤3.1.3中的管并将其转移到聚丙烯柱中。 通过加入10mL缓冲液A洗涤保留在聚丙烯柱中的珠子。让洗涤缓冲液通过重力洗脱。 用10 mL缓冲液B，10 mL缓冲液A和10mL缓冲液C重复洗涤步骤。 从机架上取下聚丙烯色谱柱，并将其放在新的2.0 mL微量离心管的顶部。用手握住立柱和管子。 向聚丙烯柱中加入300μL1%TFA，并通过上下移液5次来混合磁珠。注意：磁珠将保留在聚丙烯柱中，MHC结合的肽将在2.0 mL微量离心管中洗脱。 将洗脱液转移到新的2.0 mL微量离心管中。重复步骤3.1.11并将2个洗脱液池化（含有MHC肽复合物的洗脱液应对应于总共600μL，并将在步骤3.2.4中使用）。 （可选）收集6μL（或总体积的1/100）等分试样进行蛋白质印迹并立即冷冻。该部分对应于从磁珠中洗脱的MHC肽复合物。 MHC肽的脱盐和洗脱注意：MHC肽的脱盐和洗脱步骤可以通过将C18柱安装到2.0 mL微量离心管上来完成。为了更好地配合，请在 C18 色谱柱和 2.0 mL 微量离心管之间安装制造商提供的退火剂。在该协议中，C18色谱柱的体积容量为5-200μL（6-60μg）。所有步骤都在RT进行。 在C18柱顶部加入200μL甲醇，然后以1546× g 离心3分钟。丢弃流出。 在C18柱顶部加入200μL80N（乙腈）/ 0.1%TFA，然后以1546× g 离心3分钟。丢弃流出。 在C18色谱柱顶部加入200μL0.1%TFA，然后以1546× g 离心3分钟。丢弃流出。 将步骤3.1.12中的200μLMHC肽复合物加载到C18柱的顶部。以1546× g 离心3分钟，丢弃流经。 重复步骤 3.2.4 两次，直到加载完整个卷。请注意，MHC肽保留在C18柱中。 向C18柱中加入200μL0.1%TFA，然后以1546× g 离心3分钟。丢弃流出。 将 C18 色谱柱转移到新的 2.0 mL 微量离心管中。通过加入150μL的28N / 0.1%TFA从C18柱中洗脱MHC肽。 以1546× g 离心3分钟。 将流出物转移到新的1.5 mL微量离心管中。注意不要丢弃流出物;它含有分离的MHC I类或II类肽。 重复步骤3.2.7-3.2.9两次，总体积为450μL。 将450μL洗脱液（纯化的MHC I类或II类肽）冷冻在-20°C，直到通过LC-MSMS分析样品。 在LC-MS / MS分析之前，使用预设为45°C的真空浓缩器蒸发步骤3.2.11中纯化的MHC I类或II类肽2小时，真空度：100 mTorr和真空斜坡：5。注：冷冻样品的蒸发效率很高。干燥的肽可以重新冷冻直至分析。 4. 通过LC-MS/MS鉴定MHC I类和II类肽 注：使用高性能 Orbitrap 和高分辨率四极杆飞行时间质谱仪分析 MHC I 类和 II 类免疫肽组6。以下信息仅作为指示，考虑到各种现有的串联质谱仪器根据不同的操作标准运行。下面简要介绍这些步骤： 将干燥的样品（从步骤3.2.12开始）溶解在50μL的4%甲酸（FA）中。 为每个样品上样三次进样16μL，并在自制的反相柱（150μm内径，长度为250 mm，Jupiter 3μm C18 300 Å）上分离，梯度为5%-30N-0.1，连接到MS的纳米流UHPLC上的流速为600 nL / min。 以120000的分辨率采集每个完整的MS光谱，AGC为4 x 105 ，注射时间为自动模式，并使用串联MS（MS-MS）在最丰富的带倍电荷的前体离子上获取光谱，最长可达3秒。注意：串联-MS实验使用高能碰撞解离（HCD）进行，碰撞能量为30%，分辨率为30，000，AGC为1.5 x 105，注射时间为300 ms。 使用蛋白质组学LC-MS / MS分析软件（例如，PEAKS X）处理来自三个注射/样品的数据文件，该软件使用鼠标和人类数据库（UniProtKB / Swiss-Prot （2019_09））。 选择”未指定的酶消化”作为酶参数，选择10 ppm和0.01 Da分别对前体和片段离子的质量耐受性。注：可变修饰是脱酰胺（NQ）和氧化（M）。所有其他搜索参数都是默认值。使用蛋白质组学LC-MS / MS分析软件使用80%的ALC过滤最终肽列表，错误发现率（FDR）为1%。 5. 免疫肽组学数据的可视化 注意：MS生成的免疫肽组学数据的质量可以通过多种方式进行评估，如最近描述的那样22，23。为了可视化数据并评估其整体质量，组成和MHC特异性，可以使用MhcVizPipe（MVP）软件工具。 按照所有说明和相关文档安装并运行 Caron Lab GitHub 网站上提供的 MVP 软件24。注：MVP 提供了样品质量、成分和 MHC 特异性的快速综合视图。MVP 并行使用成熟的免疫肽组学算法（NetMHCpan25、NetMHCIIpan26 和 GibbsCluster27），并以 HTML（超文本标记语言）格式生成有组织且易于理解的报告。这些报告是完全可移植的，可以在任何具有现代Web浏览器的计算机上查看。有关 HTML 报告的示例，请参阅补充数据 1-4。