以下方案描述了用于蠕虫培养、荧光成像和自动图像处理的高通量工作流程的开发和优化,以量化聚谷氨酰胺聚集体,以评估蛋白质平衡的变化。
多年来,神经退行性蛋白质构象疾病(PCD)患病率的上升引起了人们对这一主题的极大兴趣。这种日益增加的关注要求多样化和改进能够重现PCD患者观察到的疾病表型的动物模型。虽然小鼠模型已被证明是无价的,但它们价格昂贵,并且与费力,低通量的方法有关。使用 秀丽隐杆线虫 模型来研究PCD是合理的,因为它相对容易维护,成本低,生成时间快,允许高通量应用。此外, 秀丽隐杆线虫 和人类基因组之间的高度保守使该模型成为一种宝贵的发现工具。表达荧光标记的组织特异性聚谷氨酰胺 (polyQ) 束的线虫表现出以荧光病灶为特征的年龄和 polyQ 长度依赖性聚集。这些报告员通常被用作代理来监测组织中蛋白质平衡的变化。手动聚合定量非常耗时,限制了实验通量。此外,手动病灶定量可能会引入偏差,因为总体识别可能非常主观。本文对由蠕虫培养、图像采集和数据处理组成的方案进行了标准化,以支持使用表达肠道特异性 polyQ 的秀丽隐杆线虫 进行高通量聚合定量。通过使用图像分析软件CellProfiler实现基于 秀丽隐杆线虫的图像处理管道,该方法已经过优化,可以分离和识别单个蠕虫并枚举它们各自的聚集体。虽然自动化的概念并非完全独一无二,但需要标准化这些程序以实现可重复性,消除手动计数的偏差并提高吞吐量。预计这些方法可以大大简化使用 秀丽隐杆线虫 模型的大型细菌,基因组或药物库的筛选过程。
年龄依赖性神经退行性蛋白质构象疾病(PCDs),如阿尔茨海默氏症,帕金森氏症和亨廷顿病,或肌萎缩性侧索硬化症,其特征在于蛋白质折叠错误,导致聚集,细胞死亡和组织变性1。虽然蛋白质折叠错误被认为是罪魁祸首,但这些疾病的病因尚不清楚。因此,由于缺乏对导致疾病发作和进展的因素和条件的知识,有效疗法的发展受到了阻碍。最近的研究表明,微生物组的变化会影响PCDs的发作,进展和严重程度2,3,4。然而,人类甚至小鼠微生物组的复杂性使得很难进行研究来揭示微生物对其宿主的确切影响。因此,更简单的生物体,如秀丽隐杆线虫,经常被用作发现工具5,6,7,8。最近的研究使用秀丽隐杆线虫来研究细菌对宿主蛋白平衡和疾病发病机制的影响9,10。细菌定植、激素形成和基因组变化是影响聚谷氨酰胺 (polyQ) 束聚集9,11,12 的示例性条件之一。此外,这些错误折叠的蛋白质簇在宿主内表现出polyQ长度和年龄依赖性积累,并且与运动受损9,13相关。量化荧光标记的pucta的相对简单的方法可以生成有关影响蛋白质折叠和聚集的条件,因子或药物的重要数据。
虽然荧光点状污染物的定量已被证明是一种可靠且相对简单的程序,但挑战仍然是开发一种方案,以促进对影响蛋白质聚集的化合物,细菌或条件的大规模筛选。自动化 秀丽隐杆线虫 图像处理和穿刺量化的概念并不完全新颖,因为已经开发了许多实用的支持工具14,15。然而,培养、图像采集和处理管道的集成对于消除结果的可变性和允许更高通量的筛选至关重要。
因此,本手稿的目的是标准化用于量化 秀丽隐杆线虫 中polyQ聚集的程序,作为检测蛋白平衡变化的代理。该任务是通过使用CellProfiler来完成的,CellProfiler是一种开源图像分析软件16 ,能够自动识别蠕虫和聚集体,并被集成到用于培养蠕虫、获取图像和处理数据的更大的实验方案中。
所描述的方案概述了 秀丽隐杆线虫 培养,成像和图像处理的程序,该程序结合了开源图像分析软件CellProfiler。具有代表性的结果表明了可重复性、减少偏差和可扩展性。这种标准化程序将改善大型细菌、基因组或药物文库采用的筛选策略。虽然存在其他自动化的 秀丽隐杆线虫 检测方法,但所描述的技术提供了一个标准化的,高通量的管道,集成了培养,图像采集和分析。
必须测试蠕虫培养的几种变体以优化本文中描述的方案。最初,蠕虫在年龄同步(L1阶段)后立即转移到样品细菌中。然而,这种方法导致了不同大小的蠕虫种群,甚至在同一孔内的蠕虫中也是如此。 秀丽隐杆线虫 以避免病原体19而闻名,这可能导致观察到的大小变异性,并最终影响下游成像 – 蠕虫检测,特别是。为了消除这种变异性,每个孔中的整个NGM区域都被测试细菌覆盖。此外,将蠕虫喂食 大肠杆菌 OP50,并允许在25°C下完全发育成年轻成虫48小时。 在将蠕虫转移到测试细菌上之前,让 蠕虫在大肠杆菌 OP50上达到成年期,导致更一致的体型。此外,通过用FUDR补充NGM琼脂,消除了过度拥挤和后代的快速食物消耗。FUDR的实施去除了后代并增强了自动蠕虫鉴定,这被后代与亲本群体的混合所掩盖。然而,在使用FUDR时,重要的是要谨慎并使用适当的对照,因为已知该化合物会影响 秀丽隐杆线虫 的蛋白质平衡和寿命20,21。在该协议中描述的条件下,FUDR不影响肠道polyQ聚集(补充图5);因此,其利用是合适的,并且有利于所描述的方法。
在成像之前冷冻样品被证明是成功使用管道的关键步骤。冻结前的聚合计数明显高于手动计数(图3B)。在成像之前将蠕虫保持在-20°C下18-48小时可减少背景荧光并最终改善聚集体检测(图3A)。冷冻对聚集体检测的影响仅针对polyQ进行了研究,如果不进一步研究这种影响,则不应推广到其他模型。
尽管所有条件都保持不变,但观察到每条蠕虫的平均聚集体数量在不同的运行之间可能会有所不同,而用OP50定植的动物的聚集体数量与MPAO1之间的比率保持一致(图6, 补充图2, 补充 图5)。因此,在每次运行中始终包括 大肠杆菌 OP50 对照或任何其他合适的参考对照至关重要。实验之间总计数的这种变异性可能受到环境条件(温度,湿度)22,23 或遗传背景8的影响。事实上,观察到在长时间培养后,肠道荧光急剧下降或完全丧失,这需要从冷冻储液中解冻新菌株。观察到的荧光减少可能是抑制有毒转基因(例如表达polyQ的转基因)的遗传变化的结果。尽管如此,在不同实验者之间观察到的结果(补充图2),生物重复之间(图5)和同一样品内(补充图3)的异常再现性强调了这种方法的强度。
许多报告已经使用肠道polyQ来研究蛋白停止9,11,12,13,24,25。然而,由于实验方法和读出方法之间的差异,无法对结果进行直接比较。尽管如此,来自先前发表的数据的一些结果被本文描述的自动定量所概括,包括细菌诱导聚集9,13和相当数量的聚集体11。总的来说,所描述的管道为研究蛋白质平衡提供了有价值的工具。
本文中描述的方法具有一些固有的挑战。例如,它需要足够的时间来掌握该协议的所有组件,对于该协议的第8部分尤其如此,该部分需要熟悉测定以确定所获取的图像是否适合管道分析。与该协议中使用的图像采集设置的偏差是可能的;但是,可能需要修改设置和蠕虫训练集。该管道可以区分各种大小的聚合体和正在接触的聚合体,这限制了聚合体的“混合”并最终提高了检测灵敏度。但是,在尝试识别超过可接受大小范围的大型聚合时,可能会出现问题,因为扩展大小上限阈值可能会导致标识不良导致的错误,例如无法区分正在接触的聚合。在进行图像分析之前,必须在精度、大小和强度之间找到平衡点。通过结合机器学习来创建能够增强聚合检测的神经网络,可以进一步提高聚合识别的效率。目前正在探索这种改进,这将大大有助于解决当前的问题,例如检测位于不同焦平面上或具有异常形状的聚集体。
所描述的方法的一个显着弱点是自动聚集体计数的可变性,因为它们并不总是通过喂养不同细菌菌株的蠕虫的手动计数来概括。例如,根据自动计数,与野生型菌株(MPAO1)相比,喂养 铜绿假单胞菌 突变体53(M53)的蠕虫聚集体明显少于野生型菌株(图7);然而,对命中的确认显示没有显着差异(补充图4)。一般来说,高通量药物筛选具有较高的假阳性命中检测率,所述方法无一例外26。因此,确认所有潜在命中是协议的关键部分。
虽然该方案经过优化以适应筛选策略以鉴定影响宿主蛋白平衡的细菌,但每个步骤都可以进一步修改以测试基因组RNAi文库,小分子或其他条件的影响。可以在每个步骤中进行其他修改,以适应特定筛选策略的要求。此外,该技术提供了一定程度的灵活性,允许优化每个步骤以适应特定模型。例如,这种方法可以扩展到其他组织中的polyQ聚集或提取图像中检测到的其他特征,例如使用诱导荧光报告基因(例如,热休克基因)监测基因表达,评估蛋白质的亚细胞定位(例如,DAF-16的核定位),研究其他疾病模型中的聚集(Aβ1-42,α突触核蛋白,TDP-43等)或评估生理表型, 如蠕虫大小。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了美国国立卫生研究院(1RO3AG069056-01)和美国传染病学会对DMC的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。我们感谢Czyz实验室的成员校对手稿。卡通人物是使用生物渲染付费许可证生成的。
1.7 mL Microtubes | Olympus Plastics | Cat#24-282 | Microcentrifuge tubes |
10 mL Serological Pipettes | GenClone | Cat#12-104 | Plastic pipettes |
15 mL Centrifuge Tubes, Racked | Olympus Plastics | Cat#28-101 | Conical tubes |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Fisher Scientific | D2235100MG | FUDR |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Genesee Scientific | 91-600RB | Pipette gun |
Agar | Fisher Scientific | Cat#BP1423-2 | Granulated agar |
BioRender | BioRender | Graphical figure generator | |
Bleach (Regular) | Clorox | Bar# 044600324111, Splash-less Bleach | 4.5% sodium hypochlorite |
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM140, Q35::YFP | Muscle polyQ |
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM738, Q44::YFP | Intestinal polyQ |
CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | Cat#C79-500 | Calcium chloride dihydrate |
CellProfiler | Broad Institute | Image analysis software | |
Cholesterol | Fisher Scientific | Cat#ICN10138201 | Cholesterol |
Circulating Water Bath Head | Lauda | 26LE | Lauda E 100 |
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO | CoolLED | 8114931 | Fluorescent light control and emitter |
16 mL Culture Tubes | Olympus Plastics | 21-129 | Culture tubes, 17 mm x 100 mm |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | E. coli control strain |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen | Leica Microsystems | 10450910 | Eyepiece set |
Filter Set ET GFP – MZ10F | Leica Microsystems | 10450588 | Filter cube |
GraphPad Prism v9.2.0 | GraphPad Software, Inc. | Statistical analysis tool | |
Heratherm Incubator IMP180 | Thermo | 51031562 | Refrigerated incubator |
Innova 4000 | New Brunswick Scientific | M1192-0000 | Shaking incubator |
K5 Camera | Leica Microsystems | 11547112 | Stereomicroscope camera |
KH2P04 | Fisher Scientific | Cat#P285-3 | Potassium phosphate monobasic |
LAS X Imaging Software | Leica Microsystems | Microscope imaging software | |
Leica MZ10 F Optics Carrier | Leica Microsystems | 10450103 | Stereomicroscope |
Levamisole | Fisher Scientific | Cat#0215522805 | Levamisole hydrochloride |
Luria Broth (Lennox) | Apex Bioresearch Products | Cat#11-125 | LB |
Magnetic Stir Plate | Fisher Scientific | 11-100-49S | Stir plate |
MgSO4·7H2O | Alfa Aesar | A14491 | Magnesium sulfate heptahydrate |
Microscope Slides | Premiere | 8205 | Single frosted microscope slides |
Na2HPO4·7H2O | Fisher Scientific | Cat#S373-500 | Sodium phosphate dibasic heptahydrate |
NaCl | Fisher Scientific | Cat#S671-500 | Sodium chloride |
NaOH | Fisher Scientific | Cat#S318-3 | Sodium hydroxide pellets |
Objective Achromat, f = 100 mm | Leica Microsystems | 10411597 | Objective microscope lens |
Petri Dishes | Genesee Scientific | Cat#32-107G | 100 mm x 15 mm |
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library | Manoil Lab (University of Washington) | P. aeruginosa mutant library | |
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-102 | Used for worm growth and imaging |
Trinocular Tube 100% M-series | Leica Microsystems | 10450043 | |
Trypticase Peptone | ThermoFisher, Difco | Cat#211921 | |
TX-400 Rotor | Thermo Scientific | Cat#75003181 | Swing bucket rotor |
Vacuum Driven Filter System | GenClone | Cat#25-227 | 500 mL, PES Membrane, .22 µm |
Video Objective with C-Mount | Leica Microsystems | 10447367 | 0.63x camera adapter tube |