Bu makalede, MitoTimer biyosensör ile donatılmış astrosit kültürlerinin mitokondriyal zaman atlamalı görüntüleme yöntemi ve mitokondriyal dinamiklerin, hareketliliğin, morfolojinin, biyogenezin, redoks durumunun ve cironun çokparametrik analizi açıklanmaktadır.
Nöronal düzeyde mitokondriyal değişikliklere çok dikkat edilmiş olsa da, son kanıtlar mitokondriyal dinamiklerin ve astrositlerdeki fonksiyonun bilişe karıştığını göstermektedir. Bu makalede, mitokondriyal biyosensör ile donatılmış astrosit kültürlerinin zaman atlamalı görüntülenmesi yöntemi açıklanmaktadır: MitoTimer. MitoTimer mitokondriyal dinamikleri, hareketliliği, morfolojiyi, biyogenez ve redoks durumunu değerlendirmek için güçlü ve benzersiz bir araçtır. Burada kültür, imaj edinimi ve sonraki mitokondriyal analizler için farklı prosedürler sunulmaktadır.
Astrositler beyin homeostazının bakımında kritik oyunculardır. Belki de en iyi beyinde, kan-beyin bariyeri1’in bir parçası olarak ve beyin boyunca nöronları ve sinapsları destekleyerek önemli yapısal rollere sahip oldukları bilinmektedir2. Nöronların astrosit desteği hem yapısal3 hem de metabolik4,5, nörogenez ve sinaptogenez teşvik eden astrositler ile aynı zamanda aktif nöronlara laktat gibi anahtar metabolitler sağlar 4,6,7. Yapısal destek rolünün ötesinde, astrositler Ca2+ sinyalizasyon ve tamponlamada (spontan mitokondriyal Ca2+ akınları dahil) 8,9, K+ tamponlama10‘da yer alan aktif hücrelerdir ve yaralanma zamanlarında beynin ihtiyaçlarına uyum sağlayabilen ve tepki verebilen aktif hücrelerdir11,12 . Bu tür dinamik hücreler olan astrositler, verimli bir mitokondriyal ağ gerektiren sağlam enerji gereksinimlerine sahiptir. Bu mitokondriler ayrıca aşırı reaktif oksijen türlerinin (ROS) tamponlamada çok önemli bir role sahiptir13. Enerji üretimi ve ROS arabelleğe almanın bireysel veya yerel rollerine ek olarak, mitokondri bir ağ olarak işlev görür14. Bu anlamda, sırasıyla yeni / azaltılmış mitokondri ve eski / oksitlenmiş mitokondrileri temsil eden fizyon ve füzyonmitokondrileri arasındaki dengeyi korurlar. Bir hücrenin genel redoks durumu, mitokondriyal ağın redoks durumu ile ölçülebilir. Patolojide, bu, hangi hücrelerin en iyi şekilde çalışmayabileceğine ışık tutabilecek kritik bir bilgidir.
Son yıllarda, mitokondrilerin hücrelerdeki dinamiklerini ve işlevlerini incelemek için birçok sensör geliştirilmiştir. Örneğin, mitokondriyal fonksiyon16’nınçalışmasında enerjideğişimini (ATP), redoks durumunu (NADH/NAD + , ROS) ve enzimatik işlevselliği (cAMP, Ca2+,Zn 2+) ölçen sensörler kullanılmaktadır. Bunlar arasında MitoTimer, mitokondriyal morfoloji (boyut, şekil, yüzey alanı), hareketlilik (hız, yer değiştirme) ve dinamiklerin (füzyon ve fisyon olayları) yanı sıra genel mitokondriyal ciro oranı ve redoks durumundaki değişiklikleri takip etmesine izin verir. MitoTimer bir mutant kırmızı floresan proteinidir, drFP58317, insan sitokrom c oksidaz18, 19’unalt bireyi VIII’den mitokondriyal sinyal ile yeşil(488 nm) ve oksitlenmiş mitokondrileri kırmızı (555 nm) olarak görselleştirmek için. Yeşil (488 nm) ve kırmızı (555 nm) floresan oranının kullanılması, bireysel mitokondrilerin, morfoloji analizlerinin, füzyon / fisyon olaylarının ve redoks durum geçmişinin eşzamanlı değerlendirilmesini sağlar20,21. Bu benzersiz özellik, mitokondrilerin fizyolojik ve patolojik rolleriyle ilgili birçok bilimsel soruyu araştırmak için kullanılabilir ve bu nedenle birçok farklı hücre tipinde mitokondriyal dinamiklerin altında kalan mekanizmaları ortaya çıkarmak için çok umut vericidir.
Yakın zamanda mitokondrilerin dinamiği ve fonksiyonlarını incelemek için yeni bir lentiviral vektör geliştirdik (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, bundan böyle LV-G1-MitoTimer olarak adlandırılacaktır) özellikle astrositlerde in vitro ve in vivo22. LV-G1-MitoTimer, glial fibril asidik protein (GFAP) promotörü gfaABC1D’nin kesilmiş bir versiyonunu kullanır, B3 arttırıcı (gfaABC1D(B3), bundan sonra G1 olarak adlandırılır) ve daha önce tanımlanmış miR124T nöronal detargeting sistemi23ile birlikte . Astrositlerde mitokondriyal biyosensörün özel ekspresyona izin verir in vitro ve in vivo22. Burada sunulan sıçan hipokampal astrosit kültürünü gerçekleştirmek ve onları LV-G1-MitoTimer biyosensörü ile donatmak için farklı adımların yanı sıra birkaç ardışık saat / gün boyunca astrosit mitokondri davranışını takip etmek için farklı mikroskopi adımları.
Burada, kültürlü bir astrositte mitokondriyal sistemin dinamiklerini ve cirosunu uzunlamasına takip etmek için yeni bir yöntem önerildi. Sabit bir hücre grubu veya bir seferde tek bir hücre üzerinde zaman atlamalı bir yaklaşımın aksine (literatürde en sık kullanılan)24,25, araştırmacılar aynı bireysel hücrelerde birkaç gün boyunca mitokondriyal sistemin evrimini takip edebilir. Yüksek düzeyde ışığa maruz kalmanın gerekli olduğu ve birçok hücrenin seçiminin daha az uygulanabilir olduğu tek bir canlı görüntülemenin aksine, önerilen yöntem, bu mikroskopun bir kuyunun farklı alanlarında birkaç farklı hücreyi görüntüleme ve bunları yeniden görüntülemek için çeşitli zaman noktalarında aynı hücrelere geri dönme yeteneğinden yararlanır. Her bir ilgi hücresi üzerinde ölçülen her kriter için gerçekleştirilen bir taban çizgisine normalleşme sayesinde, mitokondriyal sistemin karmaşıklığını dikkate alır ve tedavinin her hücre üzerindeki etkisini kendi temel görüntüsüne göre araştırır. Mikroskopun bu tür görüntülemeyi bir seferde 16 kuyuda otonom olarak yapabilmesi (kuyu başına 5 hücre görüntüleme), farklı günlerde çeşitli koşulları görüntülemenin getirdiği deneysel değişkenlik olmadan mitokondriyal sistemin heterojenliğinin analiz sırasında uygun şekilde dikkate alınmasını sağlar.
Kültürlerin kalitesi, LV-G1-MitoTimer biyosensörünü ifade eden viral enfeksiyon seviyeleri, mikroskop ve hedeflerin türü ve uygun hücrelerin seçimi, bu protokolde mümkün olduğunca tutarlı kalması gereken kritik değişkenlerdir. Hücre yoğunlukları, vektörün türü ve viral titreler soruya göre uyarlanabilir. Önceki çalışma LV-G1-MitoTimer ifadesinin mitokondriyal fonksiyon vedinamikler 21 , 22,26,27için zararlı sonuçları olmadığını gösterse de, konsantrasyonun hücreler için toksik olmadığını doğrulamak önemlidir (örneğin, kontroldeki toplam hücre sayısını iyi kontrol etmek). Tek bir odak düzlemi kullanıldığından, astrositler: (1) mümkün olduğunca düz, (2) diğer etiketli hücrelerden izole edilmiş (tabakta yer değiştirme durumunda analizi basitleştirmek için) ve (3) yüksek floresan seviyelerine sahip olmalıdır. Kültürdeki hücreler morfolojide oldukça değişken olabildiği için mitokondriyal sistem oldukça heterojen olabilir. Bu bağlamda, ROI’leri (tüm hücreyi değil) analiz etmek, perinükleer bölgeler gibi bazı sorunlu bölgeleri telafi eder ve değişkenliği azaltır. Taban çizgisini nispeten benzer hücreler üzerinde yapmak ve mümkün olduğunca çok hücreyi örneklamak önemlidir. Sonuç olarak, yüksek içerik toplama ve analiz mikroskopları idealdir. Bu boyuna izleme sırasında, biyosensör ağartmasını önlemek için hücreleri ışığa aşırı maruz etmemek de önemlidir.
Bu görüntüleme yöntemi karmaşıklıkları olmadan değildir ve protokol boyunca, mikroskopla önceki testler sırasında yapılan sorun gidermeyi dikkate alan birkaç not dahil edilir. Örneğin, kullanılan plaka kaplama seçimi hedeflenen teste bağlıdır, ancak astrosit birincil kültürler için en uygun seçimler için öneriler dahil edilmiştir. Ayrıca, hücreler arası değişkenlik nedeniyle durum başına en az 5 hücre üzerinde görüntü alımı yapılmalıdır. Daha spesifik olarak, temel görüntülemede seçilen bazı hücreler ölecek, bazıları atanan görüntü alma alanının çerçevesinden çıkacak ve bazıları morfolojilerini değiştirerek mitokondrilerin analizde bireyselleştirilmesini çok zorlaştıracaktır. Başlangıçtan itibaren birçok hücrenin görüntülenmesi, deneyin sonunda analiz edilebilecek kadar büyük bir hücre örnek boyutunun olasılığını artırır. Bu görüntüleme tekniğinin daha karmaşık yönlerine ek olarak, bu tür görüntüleme ve analizlerden kimlerin yararlanabileceği konusunda bazı düpedüz sınırlamalar vardır. Görüntü alımının otomatizasyondan tam olarak yararlanabilmek için, kullanılan mikroskop, görüntüler arasındaki zaman aralıklarının hızını (yani, bu protokoldeki her 3 sn) işleyebilen ve her görüntü alınmadan önce sürekli olarak söz konusu hücreye odaklanabilen bir otomatik odaklama sistemine sahip olmalıdır. Ayrıca, tüm görüntü alma işlemini otomatikleştiren JOBS yazılımı olmadan, bu yöntem, her hücreyi uygun zaman noktasında el ile bulmayı ve görüntülemeyi gerektireceğinden, görüntülenen hücre sayısına bağlı olarak zorlu ve potansiyel olarak imkansız hale gelir. Son olarak, bu görüntüleme yöntemi fotobleaching sorununa karşı bağışık değildir. Bu nedenle, her uzun vadeli satın alma yöntemide olduğu gibi, fotobleachinge daha az duyarlı floresan belirteçlerin seçilmesi ve bu sorunu mümkün olduğunca önlemek için görüntü alımının uyarılması önemlidir.
Bu teknik, şu anda çok önemli bir şekilde kullanılan diğerlerinden farklıdır. Diğer hızlandırılmış çalışmaların aksine, bu teknik tüm zaman boyunca kuyuda aynı pozisyonda görüntüleme gerektirmez ve plakanın diğer alanları görüntülemek için manuel hareketini gerektirmez. Bu, araştırmacılara birçok hücreyi bir 24 saat diliminde birçok koşulda görüntüleyebilme olanağı sağlar. Sonuç olarak, bu görüntüleme ve analizi her kuyudaki birçok hücre üzerinde yapma yeteneği, büyük bir hücre grubunu geniş bir şekilde inceleyerek elde edeceğiniz aynı popülasyon bilgilerini verirken, ayrıca görüntülenmiş her hücreden belirli önlemler sağlar. Bu yönteme ilişkin bazı özellikler diğer görüntü alma yöntemleri için geçerli olmayabilir (yukarıda özetlenmiştir), faydalar, edinimden sonra mümkün olan analiz türüyle ilgili komplikasyonlardan daha ağır basar. Bu teknik, araştırmacıların mitokondriyal sistem üzerindeki çeşitli tedavilerin ve dolayısıyla kültürlü astrositler üzerindeki kesin sonuçlarını görmelerini sağlar.
Ayrıca, bu yöntem mitokondriyal davranış ve belirli bağlamlardaki rollerle ilgili birçok farklı bilimsel soruya göre son derece özelleştirilebilir. Burada özetlenen protokol özellikle kültürlü astrositlerle ilgilidir. Bununla birlikte, diğer birçok hücre tipi kullanılabilir ve test edilebilen tedaviler sadece araştırılan sorularla sınırlıdır. Bu tür görüntüleme, mitokondriyal davranışın kolektif bilgisini ve anlayışını, mitokondriyal disfonksiyona yol açan altta kalan mekanizmaları ve birçok patolojinin farklı hücre türlerinde bulunan doğuştan gelen dinamikler üzerindeki etkilerini ilerletme potansiyeline sahiptir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, K.R. ve Lozan Üniversite Hastanesi’ne (CHUV) verilen bir Synapsis Vakfı bursu ile desteklendi. Yazarlar nikon’a yardımları için teşekkür eder, özellikle J. Gannevat’a.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |