Este artículo describe el método para la obtención de imágenes mitocondriales de lapso de tiempo de cultivos de astrocitos equipados con el biosensor MitoTimer y el análisis multiparamétrico resultante de la dinámica mitocondrial, la movilidad, la morfología, la biogénesis, el estado redox y el recambio.
Si bien se ha prestado mucha atención a las alteraciones mitocondriales a nivel neuronal, la evidencia reciente demuestra que la dinámica y la función mitocondrial en los astrocitos están implicadas en la cognición. Este artículo describe el método para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de cultivos de astrocitos equipados con un biosensor mitocondrial: MitoTimer. MitoTimer es una herramienta poderosa y única para evaluar la dinámica mitocondrial, la movilidad, la morfología, la biogénesis y el estado redox. Aquí se presentan los diferentes procedimientos para el cultivo, la adquisición de imágenes y el posterior análisis mitocondrial.
Los astrocitos son actores críticos en el mantenimiento de la homeostasis cerebral. Son quizás más conocidos por tener funciones estructurales significativas en el cerebro, como parte de la barrera hematoencefálica1 y al apoyar las neuronas y las sinapsis en todo el cerebro2. El apoyo de los astrocitos a las neuronas es tanto estructural3 como metabólico4,5,con astrocitos que promueven la neurogénesis y la sinaptogénesis, al tiempo que proporcionan metabolitos clave como el lactato a las neuronas activas4,6,7. Más allá del papel de soporte estructural, los astrocitos son células activas que participan en la señalización y amortiguación de Ca2+ (incluyendo afluencias mitocondriales espontáneas de Ca2+) 8,9,K+ buffering10,y pueden adaptarse y reaccionar a las necesidades del cerebro en tiempos delesión 11,12 . Al ser células tan dinámicas, los astrocitos tienen requisitos energéticos robustos, que requieren una red mitocondrial eficiente. Estas mitocondrias también tienen un papel crucial en la amortiguación de especies reactivas excesivas de oxígeno (ROS)13. Además de sus funciones individuales o locales de generación de energía y amortiguación de ROS, las mitocondrias funcionan como una red14. En este sentido, mantienen el equilibrio entre las mitocondrias fisionantes y fusionantes, representando mitocondrias nuevas/reducidas y mitocondrias más antiguas/oxidadas, respectivamente15. El estado redox general de una célula se puede medir por el estado redox de la red mitocondrial. En patología, esta es una pieza crítica de información que puede arrojar luz sobre qué células pueden no estar funcionando de manera óptima.
En los últimos años, se han desarrollado muchos sensores para estudiar la dinámica y las funciones de las mitocondrias en las células. Por ejemplo, los sensores que miden el intercambio de energía (ATP), el estado redox (NADH / NAD+,ROS) y la funcionalidad enzimática (cAMP, Ca2 +,Zn2 +)se utilizan actualmente en el estudio de la función mitocondrial16. Entre ellos, MitoTimer permite seguir los cambios en la morfología mitocondrial (tamaño, forma, área de superficie), movilidad (velocidad, desplazamiento) y dinámica (eventos de fusión y fisión), así como la tasa general de recambio mitocondrial y el estado redox. MitoTimer es una proteína fluorescente roja mutante, drFP58317,con una señal mitocondrial de la subunidad VIII de la citocromo c oxidasa humana18,19 para visualizar mitocondrias recién sintetizadas en verde (488 nm) y mitocondrias oxidadas en rojo (555 nm). El uso de la relación de fluorescencia verde (488 nm) y roja (555 nm) permite la evaluación simultánea de mitocondrias individuales, su análisis morfológico, eventos de fusión / fisión e historia del estado redox20,21. Esta propiedad única se puede utilizar para investigar muchas preguntas científicas sobre los roles fisiológicos y patológicos de las mitocondrias y, por lo tanto, es muy prometedora para revelar los mecanismos subyacentes de la dinámica mitocondrial dentro de muchos tipos celulares diferentes.
Recientemente desarrollamos un nuevo vector lentiviral (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, en adelante llamado LV-G1-MitoTimer) para estudiar la dinámica y las funciones de las mitocondrias específicamente en astrocitos in vitro e in vivo22. LV-G1-MitoTimer utiliza una versión truncada del promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) gfaABC1D, con un potenciador B3 (gfaABC1D(B3), en adelante G1) combinado con el sistema de destargeting neuronal miR124T descrito anteriormente23. Permite la expresión exclusiva del biosensor mitocondrial en astrocitos in vitro e in vivo22. Aquí se presentan los diferentes pasos para realizar un cultivo de astrocitos del hipocampo de rata y equiparlos con el biosensor LV-G1-MitoTimer, así como los diferentes pasos de microscopía para seguir el comportamiento de las mitocondrias de astrocitos durante varias horas / días consecutivos.
Aquí, se propone un método novedoso para seguir longitudinalmente la dinámica y el recambio del sistema mitocondrial en un astrocito cultivado. A diferencia de un enfoque de lapso de tiempo en un grupo fijo de células o una célula individual a la vez (más utilizado en la literatura)24,25, los investigadores pueden seguir la evolución del sistema mitocondrial durante varios días en las mismas células individuales. A diferencia de las imágenes en vivo de un solo pozo donde se requieren altos niveles de exposición a la luz, y la selección de muchas células individuales es menos factible, el método propuesto aprovecha la capacidad de este microscopio para obtener imágenes de varias células diferentes en diferentes áreas de un pozo y volver a esas mismas células en varios puntos de tiempo para volver a obtener imágenes de ellas. Gracias a la normalización a una línea de base realizada para cada criterio medido en cada célula de interés, se tiene en cuenta la complejidad del sistema mitocondrial y se investiga el efecto del tratamiento en cada célula en relación con su propia imagen basal. La capacidad del microscopio para llevar a cabo de forma autónoma este tipo de imágenes en hasta 16 pocillos a la vez (imágenes de 5 células por pozo) permite que la heterogeneidad del sistema mitocondrial se tenga debidamente en cuenta durante el análisis sin la variabilidad experimental que viene con la obtención de imágenes de diversas condiciones en diferentes días.
La calidad de los cultivos, los niveles de infecciones virales que expresan el biosensor LV-G1-MitoTimer, el tipo de microscopio y los objetivos, y la selección de células adecuadas son variables críticas que deben permanecer lo más consistentes posible en este protocolo. Las densidades celulares, el tipo de vector y los títulos virales se pueden adaptar de acuerdo con la pregunta. Aunque trabajos previos muestran que la expresión de LV-G1-MitoTimer no tiene consecuencias perjudiciales para la función y dinámica mitocondrial21,22, 26,27,es esencial verificar que la concentración no sea tóxica para las células (por ejemplo, verificando bien el número total de células en control). Como se utiliza un solo plano focal, los astrocitos deben ser: (1) lo más planos posible, (2) aislados de otras células marcadas (para simplificar el análisis en caso de desplazamiento en el plato), y (3) que posean altos niveles de fluorescencia. Como las células en cultivo pueden ser muy variables en morfología, el sistema mitocondrial puede ser altamente heterogéneo. En este contexto, el análisis del ROI (y no de toda la célula) compensa algunas regiones problemáticas, como las regiones perinucleares, y disminuye la variabilidad. Es esencial hacer la línea de base en células relativamente similares y muestrear tantas células como sea posible. En consecuencia, los microscopios de adquisición y análisis de alto contenido son ideales. Durante esta monitorización longitudinal, también es importante no sobreexponer las células a la luz para evitar el blanqueamiento del biosensor.
Este método de imagen no está exento de complejidades, y a lo largo del protocolo, se incluyen varias notas, que tienen en cuenta la solución de problemas realizada durante las pruebas anteriores con el microscopio. Por ejemplo, la elección del recubrimiento de placa utilizado depende del ensayo previsto, pero se han incluido recomendaciones para las opciones más adecuadas para cultivos primarios de astrocitos. Además, la adquisición de imágenes debe realizarse en al menos 5 células por condición debido a la variabilidad intercelular. Más específicamente, algunas células seleccionadas en la imagen basal morirán, algunas se moverán fuera del marco del área de adquisición de imágenes asignada y algunas cambiarán su morfología, lo que hará que las mitocondrias sean muy difíciles de individualizar en el análisis. Las imágenes de muchas células desde el principio aumentan la probabilidad de un tamaño de muestra de células lo suficientemente grande como para analizarlas al final del experimento. Además de los aspectos más complejos de esta técnica de imagen, existen algunas limitaciones absolutas en cuanto a quién puede beneficiarse de este tipo de imágenes y análisis. Para aprovechar al máximo la automatización de la adquisición de imágenes, el microscopio utilizado debe tener un sistema de enfoque automático que pueda manejar la velocidad de los intervalos de tiempo entre las imágenes (es decir, cada 3 s en este protocolo) y pueda enfocarse constantemente en la célula en cuestión antes de tomar cada imagen. Además, sin el software JOBS, que automatiza todo el proceso de adquisición de imágenes, este método se vuelve arduo y potencialmente imposible dependiendo del número de células que se muestren, ya que requeriría encontrar manualmente y obtener imágenes de cada célula nuevamente en el punto de tiempo apropiado. Finalmente, este método de imagen no es inmune al problema del fotoblanqueo. Por esta razón, como con cualquier método de adquisición a largo plazo, es importante elegir marcadores fluorescentes que sean menos susceptibles al fotoblanqueo y adaptar la adquisición de imágenes para evitar este problema tanto como sea posible.
Esta técnica difiere de otras utilizadas actualmente de una manera crucial. A diferencia de otros estudios de lapso de tiempo, esta técnica no requiere imágenes en la misma posición en el pozo todo el tiempo, ni requiere el movimiento manual de la placa para obtener imágenes de otras áreas. Esto permite a los investigadores la capacidad de obtener imágenes de muchas células en muchas condiciones en un período de tiempo de 24 horas. En consecuencia, la capacidad de llevar a cabo estas imágenes y análisis en muchas células en cada pozo proporciona la misma información de la población que se obtendría al estudiar ampliamente un gran grupo de células, al tiempo que proporciona medidas específicas de cada célula fotografiada. Si bien algunas especificidades de este método pueden no aplicarse a otros métodos de adquisición de imágenes (descritos anteriormente), los beneficios superan las complicaciones con el tipo de análisis posible después de la adquisición. Esta técnica permite a los investigadores ver las ramificaciones exactas de varios tratamientos en el sistema mitocondrial y, en consecuencia, en los astrocitos cultivados.
Además, este método es altamente personalizable para muchas preguntas científicas diferentes con respecto al comportamiento y los roles mitocondriales en contextos específicos. Aquí el protocolo descrito se ocupa específicamente de los astrocitos cultivados. Sin embargo, se pueden usar muchos otros tipos de células, y los tratamientos que se pueden probar están limitados solo por las preguntas que se están investigando. Este tipo de imágenes tiene el potencial de avanzar en el conocimiento colectivo y la comprensión del comportamiento mitocondrial, los mecanismos subyacentes que conducen a la disfunción mitocondrial y los efectos de muchas patologías en la dinámica innata presente en diferentes tipos de células.
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Synapsis otorgada a K.R. y al Hospital Universitario de Lausana (CHUV). Los autores agradecen a Nikon su ayuda, en particular a J. Gannevat.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |