Este artigo descreve o método de imagem mitocondrial time-lapse de culturas de astrócito equipadas com biosensor MitoTimer e a análise multiparamétrica resultante da dinâmica mitocondrial, mobilidade, morfologia, biogênese, estado redox e rotatividade.
Embora muita atenção tenha sido dada às alterações mitocondriais no nível neuronal, evidências recentes demonstram que a dinâmica mitocondrial e a função nos astrócitos estão implicadas na cognição. Este artigo descreve o método de imagem de lapso de tempo de culturas de astrócitos equipadas com um biosensor mitocondrial: MitoTimer. MitoTimer é uma ferramenta poderosa e única para avaliar a dinâmica mitocondrial, mobilidade, morfologia, biogênese e estado redox. Aqui, são apresentados os diferentes procedimentos de cultura, aquisição de imagens e análise mitocondrial subsequente.
Os astrócitos são atores críticos na manutenção da homeostase cerebral. Eles são talvez mais conhecidos por ter papéis estruturais significativos no cérebro, como parte da barreira hematoencefálica1 e por suportar neurônios e sinapses em todo o cérebro2. O suporte astrócito dos neurônios é estrutural3 e metabólico4,5, com astrócitos promovendo neurogênese e sinápcia, ao mesmo tempo em que fornece metabólitos-chave como lactato aos neurônios ativos4,6,7. Além do papel do suporte estrutural, os astrócitos são células ativas que participam da sinalização e tampão ca2+ (incluindo influxos mitocondriais espontâneos Ca2+) 8,9, K+ tampão10, e podem se adaptar e reagir às necessidades do cérebro em tempos de lesão11,12 . Sendo células tão dinâmicas, os astrócitos possuem requisitos de energia robustos, que necessitam de uma rede mitocondrial eficiente. Essas mitocôndrias também têm um papel crucial no tampão de espécies de oxigênio reativas excessivas (ROS)13. Além de suas funções individuais ou locais de geração de energia e tampão ROS, as mitocôndrias funcionam como uma rede14. Nesse sentido, mantêm o equilíbrio entre mitocôndrias fissionantes e fusão, representando mitocôndrias novas/reduzidas e mitocôndrias mais antigas/oxidadas,respectivamente 15. O estado geral de redox de uma célula pode ser medido pelo estado redox da rede mitocondrial. Na patologia, esta é uma informação crítica que pode lançar luz sobre quais células podem não estar funcionando de forma ideal.
Nos últimos anos, muitos sensores foram desenvolvidos para estudar a dinâmica e as funções das mitocôndrias nas células. Por exemplo, sensores que medem a troca de energia (ATP), estado redox (NADH/NAD+, ROS) e funcionalidade enzimática (cAMP, Ca2+, Zn2+) são atualmente utilizados no estudo da função mitocondrial16. Entre eles, o MitoTimer permite acompanhar as mudanças na morfologia mitocondrial (tamanho, forma, área da superfície), mobilidade (velocidade, deslocamento) e dinâmica (eventos de fusão e fissionação), bem como a taxa geral de rotatividade mitocondrial e estado redox. MitoTimer é uma proteína fluorescente vermelha mutante, drFP58317, com um sinal mitocondrial da subunidade VIII do citocromo humano c oxidase18,19 para visualizar mitocôndrias recém-sintetizadas em verde (488 nm) e mitocôndrias oxidadas em vermelho (555 nm). O uso da relação fluorescência verde (488 nm) e vermelho (555 nm) permite avaliação simultânea de mitocôndrias individuais, sua análise de morfologia, eventos de fusão/fissão e história do estado de redox20,21. Esta propriedade única pode ser usada para investigar muitas questões científicas sobre os papéis fisiológicos e patológicos das mitocôndrias e, portanto, é muito promissora para desvendar os mecanismos subjacentes da dinâmica mitocondrial dentro de muitos tipos de células diferentes.
Recentemente desenvolvemos um novo vetor lentiviral (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, de agora em diante chamado LV-G1-MitoTimer) para estudar a dinâmica das mitocôndrias e funções especificamente em astrócitos in vitro e in vivo22. O promotor LV-G1-MitoTimer usa uma versão truncada do promotor gfaABC1D (GFAP) da proteína ácida glicênica (GFAP) gfaABC1D, com um enhancer B3 (gfaABC1D(B3), doravante chamado G1) combinado com o sistema de detargeting neuronal miR124T descrito anteriormente23. Permite a expressão exclusiva do biosensor mitocondrial em astrócitos in vitro e in vivo22. Apresentados aqui estão os diferentes passos para realizar uma cultura de astrócitos hipocampais de ratos e equipá-los com o biosensor LV-G1-MitoTimer, bem como os diferentes passos de microscopia para acompanhar o comportamento das mitocôndrias de astrócitos durante várias horas/dias consecutivas.
Aqui, propõe-se um novo método para seguir longitudinalmente a dinâmica e a rotatividade do sistema mitocondrial em um astrócito culto. Ao contrário de uma abordagem de lapso de tempo em um grupo fixo de células ou uma célula individual por vez (mais frequentemente usada na literatura)24,25, os pesquisadores podem acompanhar a evolução do sistema mitocondrial durante vários dias nas mesmas células individuais. Em contraste com a imagem única e viva onde altos níveis de exposição à luz são necessários, e a seleção de muitas células individuais é menos viável, o método proposto aproveita a capacidade deste microscópio de fotografar várias células diferentes em diferentes áreas de um poço e voltar para essas mesmas células em vários pontos de tempo para reexplodê-las. Graças à normalização de uma linha de base realizada para cada critério medido em cada célula de interesse, leva em conta a complexidade do sistema mitocondrial e investiga o efeito do tratamento em cada célula em relação à sua própria imagem de linha de base. A capacidade do microscópio de realizar de forma autônoma esse tipo de imagem em até 16 poços por vez (imagens de 5 células por poço) permite que a heterogeneidade do sistema mitocondrial seja adequadamente levada em conta durante a análise sem a variabilidade experimental que vem com imagens de várias condições em dias diferentes.
A qualidade das culturas, os níveis de infecções virais expressando o biosensor LV-G1-MitoTimer, o tipo de microscópio e objetivos, e a seleção de células adequadas são variáveis críticas que devem permanecer o mais consistentes possível neste protocolo. As densidades celulares, o tipo de vetor e os títulos virais podem ser adaptados de acordo com a pergunta. Embora trabalhos anteriores demonstrem que a expressão LV-G1-MitoTimer não tem consequências deletérios para a função mitocondrial e a dinâmica21,22,26,27, é essencial verificar se a concentração não é tóxica para as células (por exemplo, verificando bem o número total de células em controle). Como um único plano focal é usado, os astrócitos devem ser: (1) o mais plano possível, (2) isolado de outras células rotuladas (para simplificar a análise em caso de deslocamento no prato) e (3) possuir altos níveis de fluorescência. Como as células na cultura podem ser altamente variáveis na morfologia, o sistema mitocondrial pode ser altamente heterogêneo. Nesse contexto, a análise de ROIs (e não toda a célula) compensa algumas regiões problemáticas, como as regiões perinucleares, e diminui a variabilidade. É essencial fazer a linha de base em células relativamente semelhantes e provar o maior número possível de células. Consequentemente, microscópios de aquisição e análise de alto conteúdo são idealmente adequados. Durante esse monitoramento longitudinal, também é importante não expor demais as células à luz para evitar branqueamento biosensor.
Este método de imagem não é sem suas complexidades, e ao longo do protocolo, várias notas são incluídas, que levam em conta a solução de problemas feitas durante testes anteriores com o microscópio. Por exemplo, a escolha do revestimento de placas utilizada depende do ensaio pretendido, mas foram incluídas recomendações para as escolhas mais adequadas para culturas primárias de astrócito. Além disso, a aquisição de imagens deve ser realizada em pelo menos 5 células por condição devido à variabilidade intercelular. Mais especificamente, algumas células selecionadas na imagem de linha de base morrerão, algumas sairão do quadro da área de aquisição de imagens atribuídas, e algumas mudarão sua morfologia, tornando as mitocôndrias muito difíceis de individualizar na análise. Imagens de muitas células desde o início aumentam a probabilidade de um tamanho amostral grande o suficiente de células para analisar no final do experimento. Além dos aspectos mais complexos desta técnica de imagem, existem algumas limitações absolutas, tanto quanto quem pode se beneficiar desse tipo de imagem e análise. Para aproveitar ao máximo a automatização da aquisição de imagens, o microscópio utilizado deve ter um sistema de foco automático que possa lidar com a velocidade dos intervalos de tempo entre as imagens (ou seja, a cada 3 s neste protocolo) e possa se concentrar consistentemente na célula em questão antes de cada imagem ser tirada. Além disso, sem o software JOBS, que automatiza todo o processo de aquisição de imagens, esse método torna-se árduo e potencialmente impossível dependendo do número de células sendo imagens, pois exigiria encontrar e fotografar manualmente cada célula novamente no momento apropriado. Finalmente, este método de imagem não é imune à questão do fotobleaching. Por essa razão, como em qualquer método de aquisição de longo prazo, é importante escolher marcadores fluorescentes menos suscetíveis à fotobleaching e adaptar a aquisição de imagens para evitar esse problema tanto quanto possível.
Essa técnica difere de outras atualmente utilizadas de forma crucial. Ao contrário de outros estudos de lapso de tempo, esta técnica não requer imagens na mesma posição no poço o tempo todo, nem requer movimento manual da placa para visualizar outras áreas. Isso permite aos pesquisadores a capacidade de imagem de muitas células em muitas condições em um período de 24 horas. Consequentemente, a capacidade de realizar essa imagem e análise em muitas células de cada poço dá à mesma informação populacional que se obteria de estudar amplamente um grande grupo de células, ao mesmo tempo em que fornece medidas específicas de cada célula. Embora algumas especificidades desse método possam não se aplicar a outros métodos de aquisição de imagem (descritos acima), os benefícios superam as complicações com o tipo de análise possível após a aquisição. Essa técnica permite que os pesquisadores vejam as ramificações exatas de vários tratamentos no sistema mitocondrial e, consequentemente, nos astrócitos cultos.
Além disso, este método é altamente personalizável para muitas questões científicas diferentes sobre o comportamento mitocondrial e papéis em contextos específicos. Aqui o protocolo delineado trata especificamente de astrócitos cultos. No entanto, muitos outros tipos de células podem ser usados, e os tratamentos que podem ser testados são limitados apenas pelas questões que estão sendo investigadas. Esse tipo de imagem tem o potencial de avançar o conhecimento coletivo e a compreensão do comportamento mitocondrial, os mecanismos subjacentes que levam à disfunção mitocondrial e os efeitos de muitas patologias sobre a dinâmica inata presente em diferentes tipos de células.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação Synapsis concedida à K.R. e ao Hospital Universitário de Lausanne (CHUV). Os autores agradecem a ajuda de Nikon, em particular J. Gannevat.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |