Dit artikel beschrijft de methode voor mitochondriale time-lapse beeldvorming van astrocytenculturen uitgerust met MitoTimer biosensor en de resulterende multiparametrische analyse van mitochondriale dynamica, mobiliteit, morfologie, biogenese, redoxtoestand en omzet.
Hoewel er veel aandacht is besteed aan mitochondriale veranderingen op neuronaal niveau, toont recent bewijs aan dat mitochondriale dynamiek en functie in astrocyten betrokken zijn bij cognitie. Dit artikel beschrijft de methode voor time-lapse beeldvorming van astrocytenculturen uitgerust met een mitochondriale biosensor: MitoTimer. MitoTimer is een krachtig en uniek hulpmiddel om mitochondriale dynamica, mobiliteit, morfologie, biogenese en redoxtoestand te beoordelen. Hier worden de verschillende procedures voor cultuur, beeldacquisities en daaropvolgende mitochondriale analyse gepresenteerd.
Astrocyten zijn cruciale spelers in het onderhoud van de homeostase van de hersenen. Ze zijn misschien het meest bekend om belangrijke structurele rollen in de hersenen, als onderdeel van de bloed-hersenbarrière1 en door het ondersteunen van neuronen en synapsen in de hersenen2. Astrocytenondersteuning van neuronen is zowel structureel3 als metabolisch4,5,met astrocyten die neurogenese en synaptogenese bevorderen en tegelijkertijd belangrijke metabolieten zoals lactaat leveren aan actieve neuronen4,6,7. Naast de rol van structurele ondersteuning, zijn astrocyten actieve cellen die deelnemen aan Ca2 + signalering en buffering (inclusief spontane mitochondriale Ca2 + instroom)8,9, K+ buffering10, en kunnen zich aanpassen en reageren op de behoeften van de hersenen in tijden van letsel11,12 . Omdat het zulke dynamische cellen zijn, hebben astrocyten robuuste energiebehoeften, die een efficiënt mitochondriaal netwerk vereisen. Deze mitochondriën hebben ook een cruciale rol bij het bufferen van overmatige reactieve zuurstofsoorten (ROS)13. Naast hun individuele of lokale rollen van energieopwekking en ROS-buffering, functioneren mitochondriën als een netwerk14. In die zin handhaven ze het evenwicht tussen splijtings- en fusie-mitochondriën, die respectievelijk nieuwe / gereduceerde mitochondriën en oudere / geoxideerde mitochondriën vertegenwoordigen15. De totale redoxtoestand van een cel kan worden gemeten aan de hand van de redoxtoestand van het mitochondriale netwerk. In de pathologie is dit een cruciaal stuk informatie dat licht kan werpen op welke cellen mogelijk niet optimaal functioneren.
In de afgelopen jaren zijn veel sensoren ontwikkeld om de dynamiek en functies van mitochondriën in cellen te bestuderen. Sensoren die bijvoorbeeld energie-uitwisseling (ATP), redoxtoestand (NADH / NAD+, ROS) en enzymatische functionaliteit (cAMP, Ca2 +, Zn2 + )meten, worden momenteel gebruikt in de studie van mitochondriale functie16. Onder hen maakt MitoTimer het mogelijk om de veranderingen in mitochondriale morfologie (grootte, vorm, oppervlakte), mobiliteit (snelheid, verplaatsing) en dynamiek (fusie- en splijtingsgebeurtenissen) te volgen, evenals de algehele mitochondriale omloopsnelheid en redoxtoestand. MitoTimer is een gemuteerd rood fluorescerend eiwit, drFP58317, met een mitochondriaal signaal van subeenheid VIII van humaan cytochroom c oxidase18,19 om nieuw gesynthetiseerde mitochondriën in groen (488 nm) en geoxideerde mitochondriën in rood (555 nm) te visualiseren. Met behulp van de groene (488 nm) en rode (555 nm) fluorescentieverhouding maakt gelijktijdige evaluatie van individuele mitochondriën, hun morfologische analyse, fusie / splijtingsgebeurtenissen en redoxtoestandsgeschiedenis20,21. Deze unieke eigenschap kan worden gebruikt om veel wetenschappelijke vragen te onderzoeken met betrekking tot de fysiologische en pathologische rollen van mitochondriën en is daarom veelbelovend voor het onthullen van de onderliggende mechanismen van mitochondriale dynamica binnen veel verschillende celtypen.
We hebben onlangs een nieuwe lentivirale vector ontwikkeld (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, hierna LV-G1-MitoTimer genoemd) om de dynamiek en functies van mitochondriën specifiek in astrocyten in vitro jp in vivote bestuderen22. LV-G1-MitoTimer maakt gebruik van een afgeknotte versie van de glial fibrillary acidic protein (GFAP) promotor gfaABC1D, met een B3 enhancer (gfaABC1D(B3), hierna G1 genoemd) in combinatie met het eerder beschreven miR124T neuronale detargeting systeem23. Het maakt exclusieve expressie van de mitochondriale biosensor in astrocyten in vitro jp in vivomogelijk 22. Hier worden de verschillende stappen gepresenteerd om een cultuur van rat hippocampale astrocyten uit te voeren en ze uit te rusten met de LV-G1-MitoTimer biosensor, evenals de verschillende microscopiestappen om het gedrag van astrocyten mitochondriën gedurende verschillende opeenvolgende uren / dagen te volgen.
Hier wordt een nieuwe methode voorgesteld om de dynamiek en omzet van het mitochondriale systeem in een gekweekte astrocyt longitudinaal te volgen. In tegenstelling tot een time-lapse-benadering op een vaste groep cellen of één individuele cel tegelijk (meestal gebruikt in de literatuur)24,25, kunnen onderzoekers de evolutie van het mitochondriale systeem gedurende meerdere dagen op dezelfde individuele cellen volgen. In tegenstelling tot single well live imaging waar hoge niveaus van blootstelling aan licht vereist zijn, en de selectie van veel individuele cellen minder haalbaar is, maakt de voorgestelde methode gebruik van het vermogen van deze microscoop om verschillende cellen in verschillende gebieden van een put in beeld te brengen en terug te keren naar diezelfde cellen op verschillende tijdstippen om ze opnieuw in beeld te brengen. Dankzij normalisatie van een basislijn die wordt uitgevoerd voor elk gemeten criterium op elke cel van belang, houdt het rekening met de complexiteit van het mitochondriale systeem en onderzoekt het het effect van de behandeling op elke cel ten opzichte van zijn eigen basisbeeld. Het vermogen van de microscoop om dit type beeldvorming autonoom uit te voeren op maximaal 16 putten tegelijk (beeldvorming van 5 cellen per put) maakt het mogelijk om tijdens de analyse goed rekening te houden met de heterogeniteit van het mitochondriale systeem zonder de experimentele variabiliteit die gepaard gaat met beeldvorming van verschillende omstandigheden op verschillende dagen.
De kwaliteit van de culturen, de niveaus van virale infecties die de LV-G1-MitoTimer biosensor tot expressie brengen, het type microscoop en doelstellingen, en de selectie van geschikte cellen zijn kritieke variabelen die zo consistent mogelijk moeten blijven in dit protocol. De celdichtheden, het type vector en de virale titers kunnen worden aangepast aan de vraag. Hoewel eerder werk aantoont dat LV-G1-MitoTimer-expressie geen schadelijke gevolgen heeft voor de mitochondriale functie en dynamiek21,22,26,27, is het essentieel om te verifiëren dat de concentratie niet giftig is voor de cellen (bijvoorbeeld het controleren van het totale aantal cellen dat goed onder controle is). Als een enkel brandpuntsvlak wordt gebruikt, moeten astrocyten: (1) zo plat mogelijk zijn, (2) geïsoleerd van andere gelabelde cellen (om de analyse te vereenvoudigen in geval van verplaatsing in de schotel) en (3) hoge fluorescentieniveaus bezitten. Omdat cellen in cultuur zeer variabel kunnen zijn in morfologie, kan het mitochondriale systeem zeer heterogeen zijn. In deze context compenseert het analyseren van ROI’s (en niet de hele cel) voor sommige problematische regio’s, zoals de perinucleaire regio’s, en vermindert de variabiliteit. Het is essentieel om de basislijn op relatief vergelijkbare cellen te doen en zoveel mogelijk cellen te bemonsteren. Daarom zijn high content acquisitie- en analysemicroscopen bij uitstek geschikt. Tijdens deze longitudinale monitoring is het ook belangrijk om de cellen niet te veel te belichten aan licht om biosensorbleking te voorkomen.
Deze beeldvormingsmethode is niet zonder complexiteit en in het hele protocol zijn verschillende opmerkingen opgenomen, die rekening houden met het oplossen van problemen tijdens eerdere tests met de microscoop. De keuze van de gebruikte plaatcoating hangt bijvoorbeeld af van de beoogde test, maar aanbevelingen voor de meest geschikte keuzes voor primaire astrocytenculturen zijn opgenomen. Bovendien moet beeldacquisitie worden uitgevoerd op ten minste 5 cellen per aandoening vanwege intercellulaire variabiliteit. Meer specifiek zullen sommige cellen die bij baseline imaging zijn geselecteerd, sterven, sommige zullen uit het kader van het toegewezen beeldacquisitiegebied bewegen en sommige zullen hun morfologie veranderen, waardoor de mitochondriën zeer moeilijk te individualiseren zijn in analyse. Het in beeld brengen van veel cellen vanaf het begin verhoogt de kans op een voldoende grote steekproefgrootte van cellen om aan het einde van het experiment te analyseren. Naast de meer complexe aspecten van deze beeldvormingstechniek, zijn er enkele regelrechte beperkingen voor wie baat kan hebben bij dit type beeldvorming en analyse. Om ten volle te profiteren van de automatisering van beeldacquisitie, moet de gebruikte microscoop een autofocussysteem hebben dat de snelheid van tijdsintervallen tussen afbeeldingen aankan (d.w.z. elke 3 s in dit protocol) en zich consequent kan concentreren op de cel in kwestie voordat elke afbeelding wordt gemaakt. Bovendien, zonder de JOBS-software, die het hele beeldacquisitieproces automatiseert, wordt deze methode moeilijk en mogelijk onmogelijk, afhankelijk van het aantal cellen dat wordt afgebeeld, omdat het nodig zou zijn om elke cel handmatig opnieuw te vinden en in beeld te brengen op het juiste moment. Ten slotte is deze beeldvormingsmethode niet immuun voor het probleem van fotobleaching. Om deze reden is het, zoals bij elke langetermijnacquisitiemethode, belangrijk om fluorescerende markers te kiezen die minder gevoelig zijn voor fotobleaching en om beeldacquisitie op maat te maken om dit probleem zoveel mogelijk te voorkomen.
Deze techniek verschilt op een cruciale manier van andere die momenteel worden gebruikt. In tegenstelling tot andere time-lapse studies, vereist deze techniek niet de hele tijd beeldvorming op dezelfde positie in de put, noch vereist het handmatige beweging van de plaat om andere gebieden in beeld te brengen. Dit stelt onderzoekers in staat om veel cellen in vele omstandigheden in één tijdsbestek van 24 uur in beeld te brengen. Bijgevolg geeft de mogelijkheid om deze beeldvorming en analyse uit te voeren op veel cellen in elke put dezelfde populatie-informatie die men zou verkrijgen door een grote groep cellen in grote lijnen te bestuderen, terwijl bovendien specifieke maatregelen van elke afgebeelde cel worden verstrekt. Hoewel sommige specifieke kenmerken van deze methode mogelijk niet van toepassing zijn op andere beeldacquisitiemethoden (hierboven beschreven), wegen de voordelen op tegen de complicaties met het type analyse dat mogelijk is na acquisitie. Met deze techniek kunnen onderzoekers de exacte vertakkingen van verschillende behandelingen op het mitochondriale systeem en bijgevolg op de gekweekte astrocyten zien.
Bovendien is deze methode zeer aanpasbaar aan veel verschillende wetenschappelijke vragen met betrekking tot mitochondriaal gedrag en rollen in specifieke contexten. Hier gaat het geschetste protocol specifiek over gekweekte astrocyten. Er kunnen echter veel andere celtypen worden gebruikt en de behandelingen die kunnen worden getest, worden alleen beperkt door de vragen die worden onderzocht. Dit type beeldvorming heeft het potentieel om de collectieve kennis en het begrip van mitochondriaal gedrag, de onderliggende mechanismen die leiden tot mitochondriale disfunctie en de effecten van vele pathologieën op de aangeboren dynamiek in verschillende soorten cellen te bevorderen.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door een Synapsis Foundation fellowship toegekend aan K.R. en het Lausanne University Hospital (CHUV). De auteurs bedanken Nikon voor hun hulp, in het bijzonder J. Gannevat.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |