I nematodi caenorhabditis selvatici sono associati a molti microbi, spesso nel lume intestinale o infettando l’intestino. Questo protocollo descrive un metodo per arricchire i microbi incolturabili che colonizzano l’intestino, sfruttando la resistenza della cuticola dauer.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha dimostrato di essere un modello eccellente per studiare le interazioni ospite-microbo e il microbioma, specialmente nel contesto dell’intestino. Recentemente, il campionamento ecologico dei nematodi selvatici Caenorhabditis ha scoperto una vasta gamma di microbi associati, tra cui batteri, virus, funghi e microsporidi. Molti di questi microbi hanno fenotipi di colonizzazione o infezione interessanti che meritano ulteriori studi, ma sono spesso incolpevoli. Questo protocollo presenta un metodo per arricchire i microbi intestinali desiderati in C. elegans e nematodi correlati e ridurre la presenza dei molti microbi contaminanti che aderiscono alla cuticola. Questo protocollo prevede di costringere gli animali nella fase di sviluppo e di utilizzare una serie di lavaggi antibiotici e detergenti per rimuovere la contaminazione esterna. Poiché gli animali dauer hanno cambiamenti fisiologici che proteggono i nematodi da condizioni ambientali difficili, tutti i microbi intestinali saranno protetti da queste condizioni. Ma, affinché l’arricchimento funzioni, il microbo di interesse deve essere mantenuto quando gli animali si sviluppano in dauers. Quando gli animali lasciano lo stadio dauer, vengono propagati singolarmente in singole linee. Le popolazioni F1 vengono quindi selezionate per i microbi desiderati o i fenotipi di infezione e contro la contaminazione visibile. Questi metodi consentiranno ai ricercatori di arricchire microbi incolturabili nel lume intestinale, che costituiscono parte del microbioma naturale di C. elegans e patogeni intestinali intracellulari. Questi microbi possono quindi essere studiati per la colonizzazione o i fenotipi di infezione e i loro effetti sulla forma fisica dell’ospite.
L’organismo modello genetico C. elegans è un eccellente sistema in vivo per studiare le interazioni ospite-microbo1,2. Hanno una fisiologia relativamente semplice rispetto ad altri animali, tuttavia, gran parte della loro biologia cellulare è fondamentalmente simile ai mammiferi, rendendoli un buon modello per la ricerca biologica1,3,4. Inoltre, sono microscopici, facili da mantenere e rimangono trasparenti per tutta la loro breve durata. Queste proprietà consentono studi rapidi sui meccanismi che governano le interazioni ospite-microbo e la visualizzazione dell’infezione in vivo e della colonizzazione degli ospiti geneticamente flessibili5,6. Infine, C. elegans risponde rapidamente alle infezioni batteriche, fungine e virali, rendendole un modello eccellente per studiare le interazioni ospite-microbo e il microbioma intestinale7,8,9.
Un aumento del campionamento di C. elegans selvatici e altri nematodi ha permesso la ricerca sull’ecologia dei nematodi viventi liberi e sulla variazione genetica naturale10,11. Allo stesso tempo, il campionamento ha anche aumentato la scoperta di patogeni biologici naturali e microbi che interagiscono con C. elegans12,13,14,15, portando alla creazione di molti sistemi modello ospite-microbo che studiano le interazioni con virus, batteri, microsporidi, oomiceti o funghi16,17,18,19,20 . Tipicamente, C. elegans selvatico si trova in steli e frutti in decomposizione, spesso in climi più temperati, e per lo più si riproducono da soli21. Quando questi campioni vengono portati in laboratorio, i nematodi selvatici vengono isolati in popolazioni clonali, trasportando una serie di microbiota associati. Quando si scoprono nuovi microbi di interesse per i nematodi Caenorhabditis, gli animali vengono spesso sottoposti a screening diretto per l’infezione o la colonizzazione al microscopio utilizzando fenotipi facilmente visualizzabili. Ad esempio, l’infezione virale può essere visualizzata come una disintegrazione delle strutture intestinali e gli stadi microsporidici possono essere visti all’interno delle cellule ospiti come spore o meroni 14,22. Quando un microbo di interesse viene scoperto per indagini future, deve essere separato dagli altri microbi contaminanti trovati nei nematodi selvatici in modo che possa essere studiato isolatamente. In molti casi, il microbo di interesse non può essere coltivato in vitro, rendendo essenziale arricchire il microbo nel nematode ospite.
Ad esempio, questo protocollo descrive un isolato selvatico di C. tropicalis contenente un batterio che colonizza all’interno del lume intestinale dei nematodi, aderendo alle cellule epiteliali intestinali in modo direzionale. Fenotipicamente, il batterio cresce perpendicolarmente lungo i lati interni del lume intestinale, dandogli un aspetto simile a una setola, visualizzato su un microscopio Normarski standard in tutte le fasi dell’animale, incluso lo stadio dauer. La placca del mezzo di crescita dei nematodi (NGM) su cui è stato coltivato questo ceppo selvatico di C. tropicalis conteneva una contaminazione visibile con altri microbi. Questo protocollo è stato sviluppato per ridurre ulteriormente la crescita microbica contaminante sulle piastre per studiare questo batterio aderente sconosciuto. I nematodi sono stati costretti allo stadio dauer per proteggere i batteri nel lume e quindi puliti utilizzando una serie di lavaggi. Successivamente, la specie batterica sconosciuta è stata identificata dalla dissezione dell’intestino e dall’amplificazione PCR del DNA ribosomiale 16S per il sequenziamento.
Nel complesso, questo protocollo può potenzialmente arricchire qualsiasi microbo di interesse associato a un nematode catturato in natura. Successivamente, i ricercatori identificheranno il microbo bersaglio, visualizzeranno i fenotipi di infezione o colonizzazione in vivo tramite microscopia e studieranno gli effetti sulla forma fisica dell’ospite o altri aspetti delle interazioni ospite-microbo. L’isolamento e lo studio di nuove specie microbiche che interagiscono con i nematodi caenorhabditis possono scoprire i meccanismi genetici dell’immunità dell’ospite e nuovi paradigmi di interazioni ospite-microbo rilevanti per la patogenesi microbica e gli studi sul microbioma.
Questo protocollo descrive l’isolamento e l’identificazione dei microbi dai nematodi caenorhabditis isolati in natura utilizzando una serie di procedure di pulizia. Numerosi microbi sono associati a nematodi isolati in natura e alcuni di essi hanno fenotipi eccitanti che possono essere utilizzati per studi futuri sulle interazioni ospite-microbo e sull’immunità innata. Molti microbiomi coltivabili e batteri patogeni sono stati isolati dai nematodi selvatici caenorhabditis utilizzando tecniche standard per la crescita batterica で vitro25,26. Tuttavia, non tutti i microbi possono essere coltivati in vitro e diventa necessario arricchirli in nematodi selvatici. Alcuni microbi hanno uno stadio di spore resistente, come i microsporidi, e alte concentrazioni di SDS possono essere utilizzate per uccidere la maggior parte dei batteri e dei funghi, consentendo un arricchimento specifico delle spore12. Questo protocollo presenta un metodo per arricchire i microbi intestinali incolti che non sono resistenti alla SDS e al trattamento antibiotico.
La tecnica qui presentata sfrutta la resistenza ambientale osservata negli animali dauer a causa di cambiamenti fisiologici come il rafforzamento della cuticola, la soppressione del pompaggio faringeo e la copertura della bocca con un tappo buccale27. Un passo critico in questo protocollo è l’incubazione notturna con vari antibiotici e 0,25% SDS. Questo passaggio viene utilizzato per uccidere tutti i microbi esterni lasciando intatti i microbi interni. Mentre C. elegans dauers ha dimostrato di sopravvivere a concentrazioni di SDS fino al 10% per 30 min27, questo protocollo utilizza un’incubazione moderata ma prolungata non solo per uccidere i microbi, ma esporre ulteriormente i batteri agli antibiotici. Inoltre, una moderata concentrazione di SDS può aiutare a garantire che i dauer di altre specie di Caenorhabditis sopravvivano, poiché l’esposizione di C. tropicalis all’1% di SDS durante la notte ha provocato la morte di tutti gli animali dauer. Se tutti i dauer muoiono, la concentrazione di SDS e/o la durata dell’esposizione alla SDS devono essere ridotte. Al contrario, se le piastre di generazione F1 hanno ancora una contaminazione visibile dopo la pulizia, la concentrazione di SDS e il tempo di incubazione dovrebbero essere aumentati.
Un altro passo critico è l’isolamento degli animali single dauer dopo la pulizia. Questo passaggio è fondamentale in quanto non tutti gli animali sono puliti dopo la SDS e il trattamento antibiotico. Pertanto, gli animali sono posti al centro di una piastra NGM di 10 cm con OP50-1 e lasciati strisciare radialmente verso l’esterno. Spesso è meglio scegliere più animali distali, poiché il strisciare esteso attraverso OP50-1 sembra aiutare a rimuovere eventuali microbi sopravvissuti attaccati alla cuticola. Tuttavia, questo porta a una limitazione del protocollo, in quanto sarà più difficile arricchire per un microbo di interesse se non è presente nella popolazione ad alta frequenza. Qui, gli alfaproteobatteri aderenti erano presenti nel 90%-95% della popolazione; pertanto, la maggior parte delle piastre pulite aveva il batterio del microbioma. Tuttavia, se un microbo di interesse è presente a una frequenza molto più bassa nella popolazione, potrebbe essere necessario schermare molte più piastre F1 .
Questo protocollo potrebbe probabilmente essere utilizzato per isolare qualsiasi numero di microbi non coltivabili di interesse trovati nei nematodi selvatici. Tuttavia, il microbo deve trovarsi in un tessuto protetto dalla cuticola dauer, in grado di sopravvivere negli animali dauer, e avere un fenotipo osservabile nell’ospite. Come tale, questa tecnica può essere utilizzata per arricchire altri batteri del microbioma nel lume intestinale oltre alle specie di alfaproteobatteri qui descritte, compresi i batteri che non aderiscono. Inoltre, il protocollo è stato utilizzato per arricchire un batterio intracellulare facoltativo, Bordetella atropi, che infetta il nematode Oscheius tipulae28. Dopo l’arricchimento, È stato scoperto che B. atropi forma colonie su piastre NGM, dimostrando che un microbo di interesse può essere scoperto essere coltivabile in vitro una volta rimossi i contaminanti a crescita più rapida. Questa tecnica probabilmente funzionerebbe per microsporidi e virus, incluso il virus Orsay, data questa capacità di arricchire un batterio intracellulare. Tuttavia, questi microbi devono essere in grado di sopravvivere alla transizione dentro e fuori da dauer.
È importante ricordare che mentre questo protocollo può essere eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza 1, è necessario mantenere una tecnica sterile per tutto il tempo per prevenire un’ulteriore contaminazione microbica. Il protocollo può essere modificato in base alle esigenze del ricercatore, compresi i tipi / concentrazioni di antibiotici, la percentuale di SDS e / o l’aggiunta di antifungini come la nistatina. Spesso, il numero di microbi contaminanti trovati in un nematode isolato in natura può variare notevolmente. Qui, l’apparente perdita di crescita di E. coli non-OP50-1 su piastre NGM è stata utilizzata come lettura per un ceppo di nematodi pulito. Ma potrebbero essere presenti popolazioni non coltivabili di microbi contaminanti, quindi è essenziale condurre un metodo di metagenomica come il sequenziamento dell’amplicone dell’rRNA 16S per vedere l’entità della contaminazione26. Una volta che il ceppo di verme viene pulito, può essere congelato e conservato per studi futuri. Nel complesso, questo protocollo consente ai ricercatori di arricchire microbi incolturabili nei nematodi selvatici, consentendo loro di studiare gli effetti sulla forma fisica dell’ospite, caratterizzare i fenotipi di colonizzazione o infezione e sfruttare gli strumenti genetici per comprendere i meccanismi alla base delle interazioni ospite-microbo.
The authors have nothing to disclose.
Grazie al Dr. Christian Braendle e al Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS) Nouragues Field Station.
Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
BD PrecisionGlide Needle – 26 G | Fisher Scientific | 305115 | |
Carbenicillin | Millipore-Sigma | C1389-1G | |
Cefotaxime | Millipore-Sigma | C7039-500mg | |
Chloramphenicol | Millipore-Sigma | C0378-25G | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | 11-303C | |
DreamTaq Polymerase | Fisher Scientific | EP0711 | |
Gentamycin | Millipore-Sigma | G1264-250mg | |
Kanamycin | Millipore-Sigma | K1876-1G | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Streptomycin | Millipore-Sigma | S6501-50G | |
Tetracyclin | Millipore-Sigma | T7660-5G | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Watch glasses | VWR | 470144-850 |