腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

1. NGMプレート上の野生の線虫のためのダウアー形成を誘導する 目的の栄養のない微生物を持つワームを得た後、食品源としてOP50-1大腸菌を用いた標準的なNGMプレート上の野生のカエノールハブディティス株を成長させます。線虫を20°Cでインキュベートする。注: カエノハブディティス 線虫を成長させる標準的な温度は15〜25°Cの間ですが、目的の微生物の損失を防ぐために経験的に決定する必要があります。 すべてのOP50-1が消費され、大部分がダウアー段階に達するまで、4〜5日間20°Cで動物のプレートを飢えさせます。注:ダウアーは、栄養不足のために発達し、保護キューティクルを持つ長命の幼虫です。 2. 線虫を洗う M9最小塩媒体(42m Na2HPO4、22 mM KH2PO4、8.6 mM NaCl、19 mM NH4Cl)の5 mLを6cmプレートに加えます。 無菌ガラスピペットと電球を使用して、プレートからM9とワームをピペットアップし、滅菌15 mL遠心分離管に移します。 臨床遠心分離機を使用して、室温で30 sの1000 x g でチューブ内のワームを回転させます。 滅菌15 mLピペットを使用して、M9上清をワームペレットの上に除去して捨てます。M9の約50 μLをワームの上に残して、チューブ下部の生きたワームを邪魔しないでください。 トリトンX-100のM9+ 0.05%を同じ遠心管に10mL加え、チューブのキャップを十分に締めます。 チューブを室温で20分間ヌテーターにインキュベートし、外部微生物を除去します。チューブをヌテレーターから取り出し、30sの場合は1000 x g でワームをスピンダウンします。 滅菌ピペットを使用して、M9上清を除去し、ワームのペレットの上に捨てます。M9の約50 μLをワームの上に残して、チューブ下部の生きたワームを邪魔しないでください。 手順 2.5 ~ 2.8 を 3 回繰り返します。 3. 線虫の消毒 0.25%SDS(250 μLの10%SDS)、カルベニシリン50 μg/mLを加えて、M9バッファーの10 mLに抗生物質とSDS溶液を調製し、 25 μg/mL のカナマイシン、12.5 μg/mL のテトラサイクリン、ゲンタマイシン 100 μg/mL、ストレプトマイシン 50 μg/mL、クロラムフェニコール 37.5 μg/mL、セフォタキシム の表200 μg/mL(材料の表を参照)。 抗生物質に線虫を含むチューブを、室温でヌテーター上のSDS溶液を一晩インキュベートします。注:すべての非ダウアーワームと胚は死ぬでしょうが、ダウアーワームの多くは、この洗浄プロセスを生き残ります。 4. 抗生物質とSDS溶液の除去 室温で1分間1000 x g でチューブ内のワームをスピンダウンします。滅菌ピペットを使用して、チューブの底部にあるワームを邪魔することなく、遠心管から上清を取り除きます。 M9 + 0.05% トリトンX-100の10 mLを加え、チューブのキャップを適切に締めます。チューブを室温で20分間、ヌテーターにインキュベートします。 チューブをヌテレーターから取り出し、1000 x g でワームを1分間回転させます。手順 4.2 ~ 4.3 を 3 回繰り返します。 最後の洗浄の後、ワームペレットを溶液の100 μLの底部に邪魔されず、残りを捨てます。 5. きれいな線虫株を伝播する 無菌ガラスピペットを使用して、OP50-1で播種した10cm NGMプレートの中央に上清とペレットの100 μLを移します。中央の液体を邪魔することなくプレートを乾燥させます。 ダウアーが中央から這い出し、OP50-1芝生を通って5-10分間クロールできるようにします。 慎重に1つのダウアーをピックアップし、6 cm NGMシードプレートにプレートします。合計で、少なくとも10ダウアーを選び、OP50-1(合計10プレート)で播種した個々の6cm NGMプレートにプレートを入れてください。 ダウアーが成長し、次の世代(F1)が成人期に達するまで、20°Cでプレートを4〜5日間インキュベートします。OP50-1以外の微生物の増殖と見なされる、すべてのプレートの汚染を視覚的に確認します。 各クリーンプレートについて、目的の表現型に応じて、ノルマルスキーまたは蛍光インザビダイラゼーション(FISH)12)などの蛍光顕微鏡を介して目的の微生物の伝播を確認します。 6. 微生物の腸管解剖とPCR同定 動物を3〜4日間20°Cで成長させ、OP50-1細菌の量を減らすことができます。飢えたワームのプレートにM9培地5mLを加えます。 無菌ガラスピペットと電球を使用して、プレートからM9 + ワームをピペットアップし、滅菌15 mL遠心分離管に移します。 臨床遠心分離機を使用して、室温で30 sの1000 x g でチューブ内のワームを回転させます。 滅菌15 mLピペットを使用して、チューブの下部にある生きたワームを邪魔することなく遠心管から上清を取り除きます。 M9 + 0.05% Triton X-100の10 mLを加え、外的な微生物を除去するために20分間、ヌテーターにチューブをインキュベートします。ワームを洗うために4回繰り返します。 最後の洗浄後、滅菌ピペットチップを使用して、溶液の100 μLで底部のペレットを乱すことなく上清を取り除きます。 無菌ピペットチップを使用して、M9とワームをシードなしのNGMプレートに移し、ワームが20分間這い回っている間にプレートを乾燥させ、キューティクルと腸からOP50-1を取り除くのに役立ちます。 乾燥したプレートにM9の250 μLを加え、ガラスピペットを使用して、M9 + ワームを新しいシードなしNGMプレートに移します。繰り返しますが、そのプレートを乾燥させ、ワームが20分間這い回るようにします。 プレートにM9の250 μLを加え、M9+ワームの100 μLをクリーンな時計ガラスに移します。 2本の無菌26G注射針を使用して、片方の針でワームを押さえ、もう一方の針を使用して線虫を切断する。切断後、体から腸(粒状)と生殖腺(透明)が自然に身体から出てきます。 一方の針で腸を押さえ、もう一方の針で切り取って、露出した腸の一部を切り取ります。注:可能であれば、ノルマルスキー顕微鏡、FISH、または免疫ヒストケミストリー23を使用して、目的の微生物が常にエバート腸に存在することを確認してください。 1回の解剖された腸を、10 μLの滅菌水を含む0.5 mL PCRチューブに移します。異なる動物からの腸を含む少なくとも5つのPCRチューブを合計する場合に繰り返します。 PCRチューブを-80 °Cで最低5分間凍結します。PCR チューブを冷凍庫から取り出し、サンプルを解凍します。 腸から細菌を分離するために数回上下に液体をピペット. 微生物の疑いのあるタイプに応じて、細菌、酵母、またはマイクロスポリディアの小さなリボソームサブユニットのDNA配列に対して、ユニバーサルプライマーペアを使用してPCRを実施します。注: 例えば、ユニバーサル細菌16Sプライマーを使用したサンプルプロトコルを 表1に示します。 フィルターベースのDNA洗浄および濃縮キット( 材料表を参照)を使用して増幅を精製し、サンガーシーケンシングを実行します。