We beschrijven geoptimaliseerde hulpmiddelen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen met fluorescentiemicroscopie van lichtplaten. In het bijzonder stellen we heldere cardiale transgene lijnen voor en presenteren we nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelings- en hartafwijkingen voorkomen. Een mogelijke data-acquisitie- en analysepijplijn aangepast aan cardiale beeldvorming wordt ook verstrekt.
Embryonaal cardiaal onderzoek heeft veel baat gehad bij de vooruitgang in snelle in vivo light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM). In combinatie met de snelle externe ontwikkeling, handelbare genetica en doorschijnendheid van de zebravis, Danio rerio, heeft LSFM inzichten opgeleverd in cardiale vorm en functie bij hoge ruimtelijke en temporele resolutie zonder significante fototoxiciteit of fotobleaching. Beeldvorming van kloppende harten daagt bestaande monstervoorbereidings- en microscopietechnieken uit. Men moet een gezond monster in een vernauwd gezichtsveld houden en ultrasnelle beelden verkrijgen om de hartslag op te lossen. Hier beschrijven we geoptimaliseerde tools en oplossingen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen. We demonstreren de toepassingen van heldere transgene lijnen voor het labelen van de cardiale bestanddelen en presenteren nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelingsstoornissen en veranderingen in de hartslag voorkomen. We stellen ook een pijplijn voor gegevensverzameling en -analyse voor die is aangepast aan cardiale beeldvorming. De hele workflow die hier wordt gepresenteerd, richt zich op embryonale hartbeeldvorming van zebravissen, maar kan ook worden toegepast op verschillende andere monsters en experimenten.
Om de complexe gebeurtenissen en interacties in het vroege kloppende hart bloot te leggen, is in vivo beeldvorming van het hele orgaan vereist. Met zijn minimale fototoxiciteit1,2,3, lage fotobleaching4 en hoge snelheid is lichtplaatmicroscopie geëvolueerd als het primaire beeldvormingsinstrument voor embryonale en cardiale ontwikkeling5,6. Het heeft inzichten opgeleverd in cardiale vorm en functie bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie7,8,9 en heeft onderzoekers in staat gesteld om fluorescerend gelabelde delen van het hart met hoge snelheid in beeld te brengen en te volgen, hemodynamische krachten te bestuderen en de hartontwikkeling direct in het lichaam van zich ontwikkelende embryo’s te volgen6,10,11,12.
Om zebravissen in het gezichtsveld nauwkeurig en reproduceerbaar te beperken, bestaan er verschillende inbeddingsprotocollen voor lichtplaat, voor de korte en lange termijn, evenals enkele of meervoudige monsters13,14,15,16,17,18,19. Het meest voorkomende protocol omvat tricaïne immobilisatie en agarose montage in een glazen of plastic buis. Omdat de hartslag echter kan veranderen als gevolg van de gebruikte temperatuur, anesthetica en inbeddingsmateriaal20,21,22, vereist beeldvorming van zebravissen specifieke, zachte protocollen om de gezondheid van het monster te waarborgen6,8,11,12,20,21,22,23 . Voor kortetermijnbeeldvorming (tot een uur) kan men de vis verdoven in 130 mg / L tricaïne en inbedden in gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP) buizen met 0,1% agarose-oplossing en een plug, zoals beschreven in Weber et al. 201416. Omdat tricaïne echter kan leiden tot ontwikkelingsstoornissen20,22, moeten verschillende protocollen worden gebruikt voor beeldvorming op lange termijn.
Hier beschrijven we een nieuwe strategie voor cardiale beeldvorming op lange termijn. Hoewel er veel lichtplaatimplementaties bestaan24, raden we aan een hangend monster in een T-SPIM-microscoop te gebruiken (één detectie- en twee verlichtingslenzen in een horizontaal vlak met het monster verticaal hangend in de gemeenschappelijke focus). Dit geeft de nodige bewegingsvrijheid en rotatie voor de precieze monsterpositionering. De vissen worden geïmmobiliseerd door 30 pg α-bungarotoxine mRNA te injecteren in het een- of tweecellige stadium. α-bungarotoxine is een slangengif dat spieren verlamt zonder de cardiovasculaire ontwikkeling of fysiologie te beïnvloeden22. Voor nauwkeurige, vervormingsvrije beeldvorming raden we aan vissen te monteren in buizen gemaakt van FEP, een polymeer met een brekingsindex die bijna identiek is aan water. We bespreken hoe we de FEP-buizen het beste kunnen voorbereiden door ze recht te trekken en te reinigen voorafgaand aan de beeldvorming. De vissen worden vervolgens in deze buizen gemonteerd, met het hoofd naar beneden, in media, en de bodem van de buis wordt afgesloten met een 2% agarose-plug, waarop viskoppen rusten. Het snijden van gaten in de FEP-buis vergemakkelijkt de gasuitwisseling en zorgt voor visgroei. De ingebedde vis kan in media worden bewaard totdat deze direct voor de beeldvorming op een monsterhouder wordt gemonteerd. We stellen ook een pijplijn voor gegevensverzameling en -analyse voor reproduceerbare high-speed imaging voor. Verder bespreken we het gebruik van cytoplasmatische versus membraanmarkertransgene lijnen voor robuuste hartceletikettering, evenals verschillende opties om het hart te stoppen. Deze montagetechnieken zorgen voor de gezondheid van het monster en maken het mogelijk om het hart nauwkeurig en reproduceerbaar in het gezichtsveld te beperken.
Transgene lijnen om het hart in beeld te brengen
Figuur 6: Vergelijking van cytoplasmatische en membraanmarker zebravis transgene lijnen. Anterieur-ventraal beeld van 48 hpf zebravisharten afgebeeld met LSFM. Witte pijlen geven structuren aan die alleen zichtbaar zijn met een transgene lijn met membraanmarkers. a) Tg(kdrl:EGFP)32 signaal in cyaan in het hart en (a’) in de ventrikel. b) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 signaal in rood in het hart en (b’) in de ventrikel. ( c,c’) samenvoeging van zowel Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) als Tg(kdrl:EGFP) signaal. Schaalbalk 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het in beeld brengen van het zebravishart vereist nauwkeurige labeling van hartcellen. Hoewel de myocardiale dikte relatief constant is in de cellen, zijn endocardiale cellen dik rond de kern, maar hebben dunne membraanuitsteeksels, in sommige regio’s dunner dan 2 μm. Cytoplasmatische transgene lijnen zoals Tg(kdrl:EGFP)32 labelen effectief de gebieden rond endocardiale kernen, maar verder weg zendt het dunne cytoplasma mogelijk niet genoeg fotonen uit om te worden gedetecteerd met zulke korte belichtingstijden, wat leidt tot kunstmatige gaten in de gegevens (figuur 6a). Daarentegen kunnen transgene lijnen van membraanmarkers zoals Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 het endocard effectief labelen en meer details onthullen (figuur 6b,c). Kies voor elk experiment zorgvuldig de meest geschikte transgene lijn.
Immobilisatie van zebravissen
De keuze van de immobilisatietechniek hangt af van de lengte van het experiment en de leeftijd van de vis om in beeld te brengen. Tricaine is vaak gebruikt voor zebravis immobilisatie, vooral vanwege het gebruiksgemak. Inderdaad, het simpelweg toevoegen van 130 mg / L tricaïne aan de vismedia resulteert in hun verdoving in 10 minuten. Omdat het kan leiden tot ontwikkelingsstoornissen en de hartfysiologie kan beïnvloeden20,22, raden we aan om tricaïne alleen te gebruiken voor korte experimenten (minder dan 30 minuten). Voor langere beeldvorming verlamt α-bungarotoxine mRNA-injecties in het een- of tweecellige stadium vissen tot 3 dagen na de bevruchting (dpf) zonder de cardiovasculaire ontwikkeling of fysiologie te beïnvloeden22.
De juiste FEP-buizen kiezen
FEP buizen zijn verkrijgbaar in verschillende diameters en diktes. Om 0-5 dpf-vis af te beelden, is 0, 8 mm een goede binnendiameter; kies voor dikwandige buizen van 0,8 x 1,6 mm of dunwandige buizen van 0,8 x 1,2 mm. We raden dunwandige buizen aan; dikkere wanden bieden echter meer stabiliteit en stijfheid, wat belangrijk kan zijn als de monsterkamer stromende media heeft die een dunne buis kunnen verstoren en verplaatsen. Voor grotere monsters kan 1,6 x 2,4 mm en 2 x 3 mm worden gebruikt.
Temperatuur- en gasuitwisseling
Een essentieel aspect van het welzijn van het zebravisembryo is temperatuur. Houd de vis idealiter op 28,5 °C tijdens het fotograferen, omdat de temperatuur van de omgeving de ontwikkeling en hartslag beïnvloedt34.
In onze ervaring handhaaft zuurstofuitwisseling via de 2% agarose-plug alleen een stabiele hartslag tot 3-4 dpf. Daarom zorgt het snijden van gaten in de buis voor zuurstofdiffusie. Het kan ook nodig zijn voor medicijnafgifte aan het monster indien gewenst.
Opschorting van hartslag.
De hoge acquisitiesnelheden van goed uitgeruste lichtplaatmicroscopen maken het mogelijk om het kloppende hart in vivo te registreren. Om echter een ongestoorde z-stack te verkrijgen, kan men het hart vertragen of stoppen. Het stoppen van het hart leidt echter tot ontspanning van de hartspier en kan leiden tot de ineenstorting van het hart6. Hartslagsuspensie kan worden gedaan met behulp van morfos, lage temperaturen, een remmer van spiercontractie of optogenetica. Deze methoden hebben elk hun nadelen en moeten voor elk experiment zorgvuldig worden geëvalueerd.
De injectie van 4 ng stil hart (sih) morfolino in het eencellige stadium kan de hartslag stoppen door zich te richten op het gen tnnt2a dat cruciaal is voor de vorming van sarcomeer35. sih zebravissen hebben geen hartslag en overleven alleen tot 7 dpf, wanneer de embryo’s beginnen te vertrouwen op circulerend bloed voor oxygenatie. Omdat de morfogenese van het hart wordt aangedreven door zowel genetische als biomechanische krachten36, vertonen deze vissen hartmisvormingen rond 3 dpf.
Omdat de stroming van Ca2+ temperatuurgevoelig is, beïnvloedt de temperatuur de hartslag bij embryonale zebravissen21. Bijgevolg vertraagt het verlagen van de temperatuur in de beeldvormingskamer de hartslag. Het stoppen van de hartslag vereist temperaturen onder de 15 °C. Omdat zebravissen meestal op 28,5 °C worden gehouden, kunnen dergelijke lage temperaturen slechts gedurende korte perioden (minder dan 10 minuten) worden gehandhaafd.
Geneesmiddelen zoals chemische remmers van spiercontracties, 2,3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM), kunnen worden toegevoegd aan de zebravismedia (50 nM37,38) om de hartslag tijdelijk op te schorten. BDM is handig in gebruik omdat het hartcontractie in minder dan 15 minuten stopt en kan worden weggespoeld om de hartfunctie te herstellen. Omdat BDM echter het hartactiepotentiaal verandert, moet het met een waarschuwing worden gebruikt37.
Ten slotte kan het hart van transgene zebravissen die licht-gated ionkanalen of pompen zoals channelrhodopsine of halorhodopsine in hun myocard tot expressie brengen, worden gemanipuleerd en gestopt door de pacemaker bij het instroomkanaal te verlichten met licht39,7,40,41,9.
Vooruitzicht
De gepresenteerde geoptimaliseerde tools en oplossingen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen, maken langdurige, zachte beeldvorming van ultrasnelle hartdynamica mogelijk. De inbedding van het monster kan worden aangepast aan verschillende beeldvormingsmodaliteiten, zoals confocale microscopie, tweefotonenmicroscopie of optische projectietomografie (OPT). Lichtplaatmicroscopie is echter waarschijnlijk de voorkeurstechniek die optische sectie biedt met een snelheid die voldoende is om de dynamiek van het hart vast te leggen. Hoewel dit protocol zich richt op embryonale hartbeeldvorming van zebravissen, geloven we dat het ook kan worden toegepast op verschillende andere monsters en experimenten. Het zal interessant zijn om in de toekomst te zien of soortgelijke inbeddings- en beeldvormingstechnieken ook in latere stadia van de ontwikkeling kunnen worden gebruikt wanneer het hart meer verborgen is en de larve minder doorschijnend.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Madelyn Neufeld voor de illustratie in figuur 2h. Dit werk werd ondersteund door de Max Planck Society, Morgridge Institute for Research, het Chan Zuckerberg Initiative en het Human Frontier Science Program (HFSP).
1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
E3 medium for zebrafish embryos | |||
Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |