Ce protocole décrit deux tests sensibles pour discriminer les déficiences motrices légères, modérées et sévères dans les modèles C. elegans de sclérose latérale amyotrophique, avec une utilité générale pour les souches de C. elegans , avec une motilité altérée.
La maladie neurodégénérative de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) présente une perte progressive des motoneurones accompagnée d’une faiblesse musculaire et d’une déficience motrice qui s’aggrave avec le temps. Bien que des progrès considérables aient été réalisés dans la détermination des facteurs génétiques de la SLA pour un sous-ensemble de patients, la majorité des cas ont une étiologie inconnue. De plus, les mécanismes sous-jacents au dysfonctionnement et à la dégénérescence des motoneurones ne sont pas bien compris; par conséquent, il est toujours nécessaire d’élaborer et de caractériser des modèles représentatifs pour étudier ces processus. Caenorhabditis elegans peut adapter son mouvement aux contraintes physiques de son environnement, avec deux paradigmes de mouvement primaires étudiés dans un environnement de laboratoire: ramper sur une surface solide et nager dans un liquide. Ceux-ci représentent une interaction complexe entre la sensation, les motoneurones et les muscles. Les modèles de la SLA de C. elegans peuvent présenter une déficience dans l’un ou l’autre de ces paradigmes de mouvement ou dans les deux. Ce protocole décrit deux tests sensibles pour évaluer la motilité chez C. elegans : un test de locomotion radiale optimisé mesurant le crawl sur une surface solide et une méthode automatisée de suivi et d’analyse de la nage dans le liquide (thrashing). En plus de la caractérisation de l’insuffisance motrice de base des modèles de SLA, ces essais peuvent détecter la suppression ou l’amélioration des phénotypes à partir d’interventions génétiques ou de petites molécules. Ainsi, ces méthodes ont une utilité pour étudier les modèles de SLA et toute souche de C. elegans qui présente une motilité altérée.
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative débilitante liée au vieillissement qui a un impact particulier sur les motoneurones. La maladie se caractérise par une perte de motoneurones dans le cerveau et la moelle épinière et une déficience motrice progressive. Il en résulte une incapacité fonctionnelle majeure et un décès prématuré, généralement dans les 3 à 5 ans suivant le diagnostic1. Des mutations dans au moins 38 gènes peuvent causer la SLA; cependant, la plupart des patients atteints de SLA accumulent des inclusions ubiquitinées de la protéine TDP-43 comme pathologie primaire dans les neurones et les cellules gliales2,3,4. Un certain nombre de modèles animaux ont été développés pour étudier les mécanismes sous-jacents causant ou contribuant à la SLA in vivo (examinés en 5). Chez C. elegans, ces modèles incluent des mutations génétiques de perte de fonction chez les homologues des gènes responsables de la SLA ou l’expression transgénique des gènes humains de la SLA. La modélisation de la SLA chez C. elegans présente de nombreux avantages. C. elegans est un animal simple et traitable avec un système nerveux différencié, des paradigmes comportementaux bien caractérisés et une homologie génétique considérable chez l’homme6,7. De nombreux outils existent pour travailler avec C. elegans, y compris des capacités robustes d’édition du génome, des rapporteurs fluorescents in vivo de la neurodégénérescence, des paradigmes de criblage de l’ARNi, une génétique traitable et des tests comportementaux et phénotypiques établis. Les modèles de la SLA de C. elegans récapitulent des aspects de la maladie humaine, y compris l’accumulation de protéines insolubles, la neurodégénérescence et la mort prématurée8,9. En outre, un dysfonctionnement moteur avec perturbation des comportements de rampe et de natation est présent dans de nombreux modèles de SLA de C. elegans.
Ce protocole décrit deux méthodes pour caractériser les phénotypes moteurs de C. elegans : le test de locomotion radiale pour évaluer le crawl sur une surface solide et l’évaluation de la nage dans le liquide (thrashing) à l’aide du suivi et de l’analyse automatisés WormLab. Ces méthodes sensibles pour caractériser les déficits moteurs permettent des comparaisons de gravité et offrent des outils pour mesurer la suppression et l’amélioration des phénotypes moteurs. Le test de locomotion radiale quantifie les différences de motilité rampante (mouvement sinusoïdal sur une surface solide) parmi les populations de vers. Ce test tire parti du comportement d’exploration naturel non stimulé de C. elegans en plaçant les vers à un seul endroit sur une plaque et en marquant leur emplacement final après une période de temps donnée10. Alternativement, nager dans des tests liquides (thrashing) compte les courbures corporelles des vers individuels sur une période de temps définie. Le comptage manuel des courbures du corps par l’œil humain prend beaucoup de temps et présente généralement une variabilité considérable entre les expérimentateurs. L’utilisation du suivi et de l’analyse automatisés assistés par ordinateur peut éliminer une grande partie de cette variabilité. En plus de la caractérisation de l’insuffisance motrice de base des modèles de SLA, les essais de locomotion radiale et de natation peuvent détecter la modulation de phénotypes locomoteurs distincts à partir d’interventions génétiques ou de petites molécules. Ces méthodes sont utiles pour étudier les modèles de SLA et toute souche de C. elegans qui présente une motilité altérée.
Locomotion radiale :
La résolution de ce test est facilement contrôlée en modifiant la variable de temps. L’augmentation de la durée facilite l’observation des différences entre les animaux présentant des phénotypes sévères, identifiant ainsi des différences subtiles. Cependant, comme ce test mesure le déplacement, si le temps de dosage est prolongé trop longtemps, les animaux ayant une motilité normale, tels que N2, se déplaceront jusqu’aux bords de la plaque et le comportement de recherche de nourriture entraînera un retour en arrière. Cela diminuera artificiellement la mesure de la distance parcourue. Des périodes trop longues peuvent entraîner la disparition des différences entre les souches, en particulier entre les animaux ayant des phénotypes moteurs moins sévères, car les animaux se dispersent uniformément dans la plaque. Raccourcir la variable de temps empêchera les vers plus actifs de trouver les bords de la plaque. Cette méthode ne suit pas la distance totale parcourue pour chaque ver, mais comprime la distance parcourue pour chaque ver dans une distance linéaire du centre de la plaque. En tant que tel, il est intrinsèquement moins robuste qu’une méthode qui enregistre la longueur totale de la piste des vers individuels. Cependant, le test de locomotion radiale nécessite très peu de formation de chercheur, utilise des réactifs relativement abordables qui sont couramment disponibles dans la plupart des laboratoires de vers, et est suffisamment sensible pour produire des résultats significatifs et reproductibles. Pour les laboratoires qui préfèrent le suivi vidéo automatisé, plusieurs méthodes ont déjà été établies pour suivre et analyser les mouvements de crawl12, ou les paramètres logiciels utilisés pour le test de natation dans ce document pourraient être modifiés pour permettre la détection et l’analyse du crawl.
Cette expérience est généralement réalisée en répliques indépendantes triples, avec un ensemble de 30 à 40 vers par réplique. Chaque réplique est divisée sur deux plaques différentes de 100 mm ou 150 mm, avec 15 à 20 vers par plaque. L’utilisation de plus de vers que recommandé par plaque peut rendre difficile la notation efficace. Un nombre total de plus de 90 est suffisamment puissant pour établir la signification d’une déficience motrice légère, modérée ou sévère. Être cohérent avec le timing entre les souches notées est essentiel pour la précision et la reproductibilité. 30 minutes sont généralement assez longues pour établir des différences entre les phénotypes modérés à sévères tels que les souches transgéniques exprimant le TDP-43 mutant humain par rapport aux vers de type sauvage (Figure 4). Si la variable de temps est prolongée, il est conseillé d’augmenter également la taille de la plaque de 100 mm à 150 mm. Des facteurs environnementaux tels que la température et l’humidité peuvent affecter ce test, qui est généralement effectué à température ambiante ambiante ambiante, il est donc important de toujours utiliser un contrôle de type sauvage (N2) lors de la comparaison entre les réplicats. De plus, ce test peut mesurer la motilité de certaines souches qui ne présentent pas un comportement de nage normal dans le liquide (battement), ce qui en fait un complément utile au test de natation.
Essai de natation:
L’utilisation du système d’imagerie et d’acquisition pour automatiser le suivi et l’analyse de la nage des vers permet d’obtenir des données rigoureuses et impartiales. Cependant, plusieurs facteurs lors de la configuration initiale de l’expérience doivent être contrôlés entre les échantillons. Ceux-ci comprennent le temps d’acclimatation au liquide avant de commencer l’enregistrement, les conditions ambiantes (c.-à-d. température, humidité) et des paramètres de lumière et d’enregistrement constants. Sur la scène de l’enregistrement, plusieurs caractéristiques aident à réduire la variabilité entre les plaques. Il s’agit notamment d’une caméra intégrée montée sur piste et d’une scène en champ lumineux qui rend l’enregistrement vidéo cohérent entre les plaques, d’un blindage autour de la scène qui empêche les reflets, l’éblouissement et les mouvements d’air pendant l’enregistrement, ainsi que d’un progiciel robuste qui détecte de manière fiable les vers et permet la correction manuelle des pistes en post-traitement vidéo. Dans ce protocole, les vidéos d’une plaque de 35 mm avec des vers sont enregistrées pendant 1 minute, puis traitées à l’aide du progiciel. Après le traitement, la correction manuelle des pistes garantit que les comportements des vers sont enregistrés avec précision sans erreurs de suivi confondantes. Les données de nombre de tours et de durée de piste sont utilisées pour déterminer les virages par minute en tant que lecture finale. Pour assurer la reproductibilité, les données sont collectées sur un minimum de 3 expériences répliquées indépendantes, chacune avec 40 à 50 animaux notés, pour atteindre un nombre final combiné d’animaux 120-150. Ce nombre est suffisant pour distinguer les petites différences de comportement de nage des vers témoins. Certains vers ont des déficits moteurs trop graves pour être capturés par des tests de natation. Par exemple, si les animaux placés dans une boucle de milieu liquide au lieu d’effectuer la réponse de battement attendue, ce test n’enregistrera pas ces mouvements avec précision et un autre test de mouvement, tel que la locomotion radiale, peut mieux capturer ces défauts de motilité. Le protocole fourni utilise un système d’imagerie disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), mais d’autres systèmes de suivi des vers peuvent fournir une utilité similaire, certains étant open source12. Les méthodes publiées précédemment décrivent la notation manuelle du thrashing de vers13. Alors que l’analyse automatisée produit un certain nombre de mesures pour chaque ver individuel, la détection des courbures du corps, mesurée en battements par minute, fournit des résultats cohérents entre les expériences et suit bien avec la notation conventionnelle des battements de vers à l’œil.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les évaluateurs pour leurs commentaires et suggestions utiles. Nous remercions Aleen Saxton, Brandon Henderson et Jade Stair pour leur assistance technique exceptionnelle. Nous remercions Brian Kraemer et Rebecca Kow pour leur aide dans l’élaboration de ces essais. Ce matériel est le résultat d’un travail soutenu par des ressources et de l’utilisation des installations du système de soins de santé VA Puget Sound. Ce travail a été soutenu par une subvention des États-Unis (U.S.) Service de recherche et de développement de laboratoire biomédical du ministère des Anciens Combattants (VA) [Subvention d’examen du mérite #I01BX004044 à la N.F.L.]
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |