Croissance, purification et titrage du virus oncolytique de l’herpès simplex

Les virus oncolytiques (VE) sont une forme émergente et unique d’immunothérapie du cancer. Les OV se répliquent sélectivement dans les cellules tumorales et les lysent (épargnant les cellules normales/saines)¹ tout en induisant une immunité antitumorale². Le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV) est l’un des virus les plus étudiés parmi tous les OVs. Il est le plus avancé dans la clinique, talimogene laherparepvec (T-VEC) étant le premier et le seul OV à recevoir l’approbation de la FDA aux États-Unis pour le traitement du mélanome avancé³. En plus du T-VEC, de nombreux autres oHSVs génétiquement modifiés sont testés précliniquement et cliniquement dans différents types de cancer^3,4,5,6,7,8. La biotechnologie avancée actuelle de l’ADN recombinant a encore augmenté la faisabilité de l’ingénierie de nouveaux oHSVs codant pour le(s) transgène(s) thérapeutique(s)^3,5. Un système efficace de propagation, de purification et de détermination du titre de l’oHSV est essentiel avant qu’un oHSV (nouvellement développé) puisse être testé pour des études in vitro et in vivo. Cet article décrit une méthode simple étape par étape de croissance de l’oHSV (dans les cellules vero), de purification (par la méthode de gradient de saccharose) et de titrage (par un dosage de plaque de l’oHSV dans les cellules de Vero)(Figure 1). Il peut être facilement adopté dans n’importe quel laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) pour obtenir un stock viral de haute qualité pour les études précliniques.

Vero, une lignée cellulaire de rein de singe vert africain, est la lignée cellulaire la plus couramment utilisée pour la propagation de l’oHSV^{9,10,11,12, 13}car^les cellules Vero ont une voie de signalisation antivirale d’interféron^{défectueuse 14.} D’autres lignées cellulaires avec stimulateur inactivé des gènes d’interféron (STING) signalisation peuvent également être utilisés pour la croissance de l’oHSV^12,13. Ce protocole utilise des cellules Vero pour la croissance d’oHSV et l’analyse de plaque. Après la propagation, les cellules infectées par le vHSo sont récoltées, lysées et soumises à une purification, dans laquelle les cellules lysées sont d’abord traitées avec de la nucléase benzonase pour dégrader l’ADN de la cellule hôte, empêcher l’agrégation acide nucléique-protéine et réduire la viscosité du lysat cellulaire. Comme l’activation correcte de la benzonase nécessite souvent^mg2+,1-2 mM_MgCl2 est utilisé dans ce protocole^15. Les débris de cellules hôtes du lysat de cellules benzonase-traités sont en outre éliminés par filtration en série avant la centrifugation à gradient de saccharose à grande vitesse. Un coussin visqueux de solution de saccharose à 25% aide à assurer un taux de migration plus lent du virus à travers la couche de saccharose, laissant les composants liés à la cellule hôte dans le surnageant, améliorant ainsi la purification et limitant la perte de virus dans la pastille^16. L’oHSV purifié est ensuite titré sur les cellules Vero, et les plaques virales sont visualisées par coloration Giemsa¹⁷ ou coloration X-gal (pour lacZ codant oHSVs)^18.