Este artigo fornece uma metodologia detalhada para a dosagem de isolevuglandinas em tecidos por imunofluorescência usando o anticorpo ScFv D11 conjugado à fosfatase alcalina. Modelos de hipertensão em camundongos e humanos são usados para explicar os procedimentos passo a passo e os princípios fundamentais associados à dosagem de isolevuvolina em amostras de tecido.
As isovuglandinas (IsoLGs) são gama-cetoaldeídos altamente reativos formados a partir de isoprostanos H2 através da peroxidação lipídica e proteínas de ligações cruzadas que levam à inflamação e a várias doenças, incluindo hipertensão. A detecção do acúmulo de IsoLG nos tecidos é crucial para esclarecer seu envolvimento nos processos da doença. No entanto, a medição de IsoLGs em tecidos é extremamente difícil, e as ferramentas atualmente disponíveis, incluindo análise por espectrometria de massa, são trabalhosas e extremamente caras. Aqui descrevemos um novo método para detecção in situ de IsoLGs em tecidos usando fosfatase alcalina conjugada D11 ScFv e um anticorpo recombinante phage-display produzido em E. coli por microscopia de imunofluorescência. Quatro controles foram utilizados para validar a coloração: (1) coloração com e sem D11, (2) coloração com extrato periplasmático bacteriano com o ligante fosfatase alcalina, (3) coloração de anticorpos scFV irrelevantes e (4) controle competitivo com IsoLG antes da coloração. Demonstramos a eficácia da fosfatase alcalina conjugada D11 em tecidos humanos e de camundongos com ou sem hipertensão. Este método provavelmente servirá como uma ferramenta importante para estudar o papel das IsoLGs em uma ampla variedade de processos patológicos.
As isovuglandinas (IsoLGs), também conhecidas como isocetolas, são isômeros da família dos 4-cetoaldeídos, que são produtos da peroxidação lipídica, reagem com e aduzem aminas primárias sobre proteínas 1,2. IsoLGs têm sido implicados em várias doenças, incluindo doenças cardiovasculares, Alzheimer, pulmonares e hepáticas, e muitos tipos de câncer3. As isoLGs têm sido mais extensamente estudadas em sua contribuição para a doença cardiovascular (DCV), que é um fardo econômico e de saúde significativo em todo o mundo, incluindo os Estados Unidos. Estima-se que 92,1 milhões de adultos norte-americanos tenham pelo menos um tipo de DCV, com projeções estimadas para 2030 chegando a 43,9% da população adulta dos EUA4. A redução da pressão arterial, do colesterol e a cessação do tabagismo reduzem o risco global e a ocorrência de eventos cardiovasculares5.
A hipertensão arterial ou hipertensão arterial é um importante fator de risco para doenças cardiovasculares e afeta aproximadamente metade da população norte-americana6. Estudos anteriores descobriram que a inflamação é uma causa subjacente de hipertensão e que os IsoLGs desempenham um papel7. Estímulos hipertensivos, incluindo angiotensina II, catecolaminas, aldosterona e excesso de sal na dieta, induzem o acúmulo de IsoLG em células apresentadoras de antígenos, incluindo células dendríticas (DCs), que por sua vez ativam células T para proliferar e produzir citocinas inflamatórias que contribuem para a hipertensão 8,9.
Anteriormente, as IsoLGs foram dosadas por imunohistoquímica, espectrometria de massa, ensaio imunoenzimático e citometria de fluxo10,11. Para facilitar a dosagem de IsoLGs, um anticorpo recombinante (D11) de variável de fragmento de cadeia única (scfv) foi desenvolvido contra IsoLGs12. Inicialmente, esse anticorpo D11 continha um E-tag de 11 aminoácidos e necessitava de um anticorpo secundário para detecção imunoistoquímica11. No entanto, foi difícil encontrar um anticorpo secundário confiável contra o E-tag após a interrupção de sua produção pelo fabricante. Portanto, desenvolvemos um protocolo confiável para coloração por imunofluorescência de IsoLGs usando D11 conjugado com fosfatase alcalina (D11-AP), que demonstramos em tecidos de camundongos e humanos com e sem hipertensão.
O D11 tem sido amplamente utilizado para detectar proteínas aduzidas por IsoLG em células ou tecidos como marcador de inflamação ou estresse oxidativo na doença 8,9,20. Anteriormente, o D11 continha um tag E e o desenvolvimento de IHQ exigiu o uso de um anticorpo anti-tag anti-E secundário conjugado com HRP10,20,21. Aqui, desenvolvemos e otimizamos um protocolo para detecção de proteínas aduzidas por IsoLG usando o anticorpo D11 conjugado com fosfatase alcalina no lugar do E-tag, o que elimina a necessidade de incubação secundária de anticorpos.
Para determinar a especificidade do D11-AP, quatro experimentos de controle negativo foram realizados. Realizamos o protocolo sem a presença do D11 e tivemos evolução mínima. Esses resultados têm dupla indicação: a fosfatase alcalina endógena não está contribuindo para o desenvolvimento, e a coloração observada é devida ao D11 e não a outro fator contribuinte. Em seguida, coramos as lâminas com o ligante AP sem D11. Este experimento resultou em pouca coloração, o que indica que a PA livre ou outros fatores no extrato periplasmático não estão causando a coloração que observamos na presença de D11. Para garantir a especificidade de D11 para IsoLG, pré-incubamos D11-AP com IsoLG purificado antes de colorir as lâminas. Observamos uma diminuição no desenvolvimento, o que indica que a D11-AP estava ligada à proteína IsoLG, esgotando assim a quantidade de D11-AP livre para se ligar à IsoLG presente no tecido. Finalmente, para garantir que D11-AP estava ligando ao IsoLG e não à proteína MSA à qual o IsoLG estava ligado, pré-incubamos o D11-AP apenas com MSA. Não houve alterações no desenvolvimento, indicando que a D11-AP não se ligou à MSA, mas sim à proteína IsoLG. Por fim, os pesquisadores que desenvolveram o protocolo de coloração foram cegos para o estado hipertensivo do tecido intestinal humano. As diferenças de coloração observadas entre pacientes hipertensos e normotensos não foram devidas a viés e já foram previamente descritas22,23.
Embora nosso protocolo para detecção de proteínas aduzidas por IsoLG usando o anticorpo D11 conjugado com fosfatase alcalina no lugar do E-tag seja rigoroso e robusto e elimine a necessidade de incubação secundária de anticorpos, ele tem algumas limitações. Uma limitação é que utilizamos D11 conjugado com fosfatase alcalina no extrato periplasmático, podendo haver falsa coloração de fosfatase alcalina endógena no extrato periplasmático ou em determinados tecidos, como intestino24. No entanto, o primeiro passo para o desenvolvimento desse protocolo incluiu a desativação da fosfatase alcalina endógena que pode estar presente nos tecidos25. Inicialmente, ácido acético frio, BME e Levamisole26 foram testados quanto à eficiência. Nenhum deles diminuiu completamente a presença de fosfatase alcalina endógena ativa. O calor tem sido usado para desativar a fosfatase alcalina27, por isso testamos a desativação térmica da fosfatase alcalina em diferentes tampões. Encontramos lâminas aquecidas e hidratadas em tampão citrato que eliminaram a maior parte da fosfatase alcalina endógena. As lâminas foram desenvolvidas inicialmente utilizando um substrato quimioluminescente/fluorescente, mas quando imageadas sem este substrato, houve uma grande quantidade de autofluorescência. VectorRed é um substrato que se desenvolve na presença de fosfatase alcalina para produzir um cromógeno que pode ser visualizado na faixa de canais Texas Red/TRITC. Usando este substrato, pudemos observar mais facilmente o sinal acima da autofluorescência de fundo. Cuidados devem ser tomados durante o processo de coloração para minimizar a coloração artefactual. A secagem dos tecidos nas lâminas após a hidratação até a aquisição de imagens resultou em maior desenvolvimento. D11-AP deve ser aliquotado e armazenado a -20 °C. Vários ciclos de congelamento-descongelamento devem ser evitados ao trabalhar com D11-AP. A solução salina tamponada com fosfato (PBS) também pode afetar a atividade enzimática da fosfatase alcalina e não deve ser usada como tampão de lavagem28. Como acontece com qualquer abordagem baseada em anticorpos, testes e otimização completos devem ser realizados para garantir que a coloração seja específica e que o sinal não seja amplificado ou não seja amplificado.
Em conclusão, desenvolvemos um protocolo otimizado poderoso, rigoroso e robusto para detectar proteínas aduzidas por IsoLG usando o anticorpo D11 conjugado com fosfatase alcalina no lugar do E-tag. Este protocolo apresenta várias vantagens: Primeiro, o uso de D11 como proteína de fusão de fosfatase alcalina é mais barato. D11 foi originalmente derivado de uma biblioteca de anticorpos de fago que não podia ser comercializada e era caro para purificar. Embora D11 no extrato periplasmático de E. coli possa fornecer uma alternativa barata, foi ineficaz na maioria dos ensaios. Em segundo lugar, a abordagem de fusão de fosfatase alcalina permite que o D11 scfv tenha um repórter útil15 (fosfatase alcalina) fundido a ele e não precisaria ser purificado para uso em imunoensaios, pois substratos estão comercialmente disponíveis. Terceiro, a fosfatase alcalina de E. coli forma dímeros29. Assim, a D11, quando fusionada à fosfatase alcalina, também formaria dímeros e isso aumentaria a avidez e a atividade de ligação do anticorpo30. Finalmente, D11 conjugado com fosfatase alcalina em extrato periplasmático pode ser facilmente limpo usando Cibacron Blue Sepharose. D11 tem um ponto isoelétrico alto (~9,2 pH). Como tal, é carregado positivamente e pode ligar-se ao Cibacron Blue através de interações pi-cátion. A maioria das impurezas do extrato periplasmático de E. coli pode ser eluída da resina. O D11 conjugado com fosfatase alcalina pode então ser eluído usando sal alto (~1,5M NaCl) em água. O D11 eluído conjugado com fosfatase alcalina é bastante estável a 4-8 °C na solução salina alta. Assim, desenvolvemos um protocolo que não só disponibiliza o anticorpo D11 a baixo custo, mas também elimina as etapas extras e a necessidade de incubação do anticorpo secundário. Este protocolo facilita a medição reprodutível de IsoLGs, que se acumulam nos tecidos em múltiplas doenças onde o aumento do estresse oxidativo desempenha um papel.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 e R03HL155041 para A.K. Agradecemos ao Digital Histology Shared Resource – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 pela visualização e digitalização das lâminas.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |