Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie

Acetyl-CoA ist der grundlegende Baustein verschiedener Biomoleküle, einschließlich neutraler Lipide (NLs), die als vielseitige biomolekulare Währung für den Aufbau von Membranen, die Erzeugung von ATP und die Regulierung der Zellsignalisierung dienen^1,2. Die Verfügbarkeit von NLs, die in einen dieser jeweiligen Pfade geschoben werden können, wird teilweise durch ihre Speicherung reguliert. Lipidtröpfchen (LDs), zytoplasmatische Organellen, die aus hydrophoben Kernen von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) bestehen, sind die Hauptspeicherkompartimente der meisten zellulären NLs. Als solche sequestrieren und regulieren LDs NLs, die abgebaut und anschließend für biochemische und metabolische Prozesse genutzt werden können^3,4. Es ist bekannt, dass die Fehlregulation von NL- und LD-assoziierten Proteinen mit dem Auftreten von Pathologien wie Lipodystrophie und metabolischen Syndromen korreliert^5,6. Aus diesem So konzentriert sich die aktuelle LD-Forschung intensiv darauf, wie die NL-Synthese räumlich, zeitlich und über verschiedene Gewebe mehrzelliger Organismen hinweg reguliert wird. Aufgrund der allgegenwärtigen zellulären Rolle für NLs sind viele Enzyme, die für die Synthese und Regulation von NLs verantwortlich sind, in allen Eukaryoten^{erhalten 7}. Tatsächlich speichern sogar einige Prokaryoten NLs in LDs⁸. Daher waren genetisch traktierbare Modellorganismen wie Saccharomyces cerevisiae (Knospenhefe) für die Untersuchung der NL-Synthese und -Regulation nützlich.

Die Trennung und Quantifizierung von NLs aus Zellextrakten kann auf vielfältige Weise erreicht werden, einschließlich Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (UPLC-MS)^9,10,11. Die vielleicht einfachste Methode zur Trennung von NLs ist die Dünnschichtchromatographie (TLC), die eine anschließende densitometrische Quantifizierung aus einer Standardkurve^12,13ermöglicht. Obwohl TLC nur eine kurskörnige Trennung von NLs bietet, bleibt es eine leistungsstarke Technik, da es kostengünstig ist und die schnelle Trennung von NLs von mehreren Proben gleichzeitig ermöglicht. Zwei der größten Herausforderungen bei der Untersuchung von NLs mittels TLC sind: 1) das breite Spektrum der zellulären Häufigkeiten von NL-Spezies und ihren Zwischenprodukten und 2) das Spektrum der Hydrophilie / Hydrophobie von Lipidzwischenprodukten innerhalb der NL-Synthesewege. Folglich ist die Quantifizierung von NL-Arten über TLC typischerweise auf die am häufigsten vorkommenden Arten beschränkt; Die Einführung einer 14-C-Essigsäure-Radiomarkierung kann jedoch den Nachweis von Zwischenprodukten mit geringer Abundanz innerhalb von NL-Signalwegen erheblich verbessern. Essigsäure wird durch die Acetyl-CoA-Synthetase ACS2¹⁴schnell in Acetyl-CoA umgewandelt, wodurch ¹⁴C-Essigsäure ein geeignetes Radiomarkierungssubstrat in Hefe¹⁵ist. Zusätzlich kann die Trennung sowohl von hydrophoben NLs als auch von hydrophilen Zwischenprodukten von NLs durch TLC durch den Einsatz mehrerer Lösungsmittelsysteme erreicht werden¹⁶. Hier wird ein Verfahren zur Trennung von NLs mittels ¹⁴C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung in Hefe vorgestellt. Lipide, die während der Pulszeit markiert werden, werden anschließend durch ein gut etabliertes Totallipidisolationsprotokoll¹⁷isoliert, gefolgt von der Trennung der NL-Spezies durch TLC. Die Entwicklung von TLC-Platten sowohl durch Autoradiographie zur Visualisierung markierter Lipide als auch durch ein chemisches Spray zur Visualisierung von Gesamtlipiden ermöglicht mehrere Quantifizierungsmethoden. Einzelne Lipidbänder können auch leicht mit einer Rasierklinge aus der TLC-Platte extrahiert werden, und die Szintillationszählung kann verwendet werden, um die Menge an radioaktiv markiertem Material innerhalb des Bandes zu quantifizieren.