La cristalografía de proteínas de neutrones es una técnica estructural que permite la localización de átomos de hidrógeno, proporcionando así importantes detalles mecanicistas de la función de la proteína. Presentamos aquí el flujo de trabajo para el montaje de un cristal de proteína, la recopilación de datos de difracción de neutrones, el refinamiento de la estructura y el análisis de los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones.
La cristalografía de neutrones es una técnica estructural que permite determinar las posiciones de los átomos de hidrógeno dentro de macromoléculas biológicas, proporcionando información mecánicamente importante sobre los estados de protonación e hidratación sin inducir daño por radiación. La difracción de rayos X, por el contrario, proporciona solo información limitada sobre la posición de los átomos de luz y el haz de rayos X induce rápidamente el daño por radiación de cofactores fotosensibles y centros metálicos. Aquí se presenta el flujo de trabajo empleado para las líneas de haz IMAGINE y MaNDi en el Laboratorio Nacional de Oak Ridge (ORNL) para obtener una estructura de difracción de neutrones una vez que se ha cultivado un cristal de proteína de tamaño adecuado (> 0,1 mm3). Demostramos el montaje de cristales de proteínas hidrogenadas en capilares de cuarzo para la recopilación de datos de difracción de neutrones. También se presenta el proceso de intercambio de vapor de los cristales montados con tampón que contiene D2O para garantizar el reemplazo de átomos de hidrógeno en sitios intercambiables con deuterio. La incorporación de deuterio reduce el fondo derivado de la dispersión incoherente de los átomos de hidrógeno y evita la cancelación de densidad causada por su longitud de dispersión coherente negativa. Las estrategias de alineación de muestras y recolección de datos a temperatura ambiente se ilustran utilizando la recolección de datos cuasi-Laue en IMAGINE en el Reactor de Isótopos de Alto Flujo (HFIR). Además, el montaje de cristales y la congelación rápida en nitrógeno líquido para la recopilación de criodatos para atrapar intermedios de reacción lábil se demuestran en el instrumento de tiempo de vuelo MaNDi en la fuente de neutrones de espalación (SNS). También se abordará la preparación de los archivos de datos de coordenadas y difracción del modelo y la visualización de los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones (SLD). Finalmente se discutirá el refinamiento de la estructura contra datos de neutrones solo o contra datos conjuntos de rayos X / neutrones para obtener una estructura de todos los átomos de la proteína de interés. El proceso de determinación de una estructura neutrónica se demostrará utilizando cristales del polisacárido lítico monooxigenasa Neurospora crassa LPMO9D, una metaloproteína que contiene cobre implicada en la degradación de polisacáridos recalcitrantes a través de la escisión oxidativa del enlace glicosídico.
La cristalografía macromolecular de neutrones es una técnica que proporciona una ventana única a la estructura y la química subyacente de las proteínas. Conceptualmente similar a la difracción de rayos X, la difracción de neutrones proporciona detalles atomísticos de la estructura macromolecular, sin embargo, la interacción de neutrones con núcleos permite la localización de átomos de luz, a menudo difíciles de detectar con difracción de rayos X1. Durante la difracción de rayos X, los rayos X se dispersan desde la nube de electrones, haciendo que los átomos de luz como el hidrógeno (H) sean poco visibles en los mapas de densidad de electrones que no tienen una resolución cercana a la sub-Ångström2. En contraste, la intensidad de dispersión de los neutrones depende de interacciones complejas con el núcleo, con isótopos del mismo elemento que muestran diferentes longitudes de dispersión. Por lo tanto, los átomos de luz y sus isótopos, como el hidrógeno (1H) y el deuterio (2H o D), tienen una visibilidad comparable a los átomos de carbono, nitrógeno y oxígeno de la columna vertebral en los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones (SLD). Además, dado que la magnitud de la dispersión de neutrones es independiente del número de electrones, la dispersión de elementos ligeros no se ve oscurecida por elementos pesados cuando están muy cerca unos de otros, como se observa en la dispersión de rayos X. La visibilidad mejorada de H y su isótopo D al emplear la difracción de neutrones proporciona información valiosa sobre el estado de protonación de residuos, cofactores y ligandos catalíticamente importantes y ayuda a la orientación de las moléculas de agua, revelando información importante sobre los mecanismos catalíticos y la química de las proteínas3. La difracción neutrónica también ofrece la ventaja de ser una técnica no destructiva, especialmente adecuada para muestras biológicas sensibles a la ionización como proteínas con centros metálicos o cofactores redox fotosensibles2. El objetivo principal de este artículo es proporcionar una visión general del flujo de trabajo para obtener una estructura cristalina de proteína de neutrones de alta calidad. Remitimos al lector interesado a Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 y O’Dell et al.3 para una excelente visión general de la difracción de proteínas neutrónicas y Ashkar et al.7 para otras aplicaciones de dispersión de neutrones.
Los neutrones se generan principalmente durante las reacciones nucleares empleando cualquiera de dos procesos: fisión nuclear en fuentes de reactores o espalación en fuentes basadas en aceleradores8. Las fuentes de reactores proporcionan un haz de neutrones continuo mediante el empleo de la fisión nuclear del isótopo 235U, mientras que las fuentes de neutrones de espalación producen un haz de neutrones pulsados bombardeando un objetivo, por ejemplo, un metal líquido como el mercurio, con protones9. El Laboratorio Nacional de Oak Ridge (ORNL) en Oak Ridge, Tennessee, alberga una fuente de neutrones de estado estacionario en el reactor de isótopos de alto flujo (HFIR) y una fuente pulsada de 60 Hz en la fuente de neutrones de espalación (SNS). La línea de haz IMAGINE, ubicada en el HFIR, es un difractómetro de neutrones optimizado para macromoléculas biológicas (Figura suplementaria 1)10. IMAGINE emplea un detector de placas de imagen de neutrones para medir datos cuasi-Laue utilizando un paso de banda estrecho en el rango de 2.8 – 4.5 Å de cristales individuales con bordes de celda unitaria <150 Å. El difractómetro de neutrones macromoleculares (MaNDi), ubicado en el SNS, es un difractómetro de neutrones Laue de tiempo de vuelo (TOF) equipado con un marco de matriz de detectores esféricos (DAF) (Figura suplementaria 2)11. MaNDi mide datos de cristales individuales con bordes de celdas unitarias en el rango de 10 – 300 Å empleando un ancho de banda sintonizable de 2 longitudes de onda Å entre 2.0 – 6.0 Å12.
El proceso de generación de neutrones es altamente intensivo en energía, lo que resulta en flujos de haz de neutrones relativamente débiles cuando se contrasta con los flujos de haz de rayos X en fuentes de sincrotrón13. Para garantizar unas relaciones señal-ruido suficientes durante la recogida de datos, es necesario cultivar cristales de tamaño y calidad adecuados14. Normalmente, se necesitan cristales con volúmenes > 0,1 mm3 para recopilar datos con estadísticas adecuadas15. Además de los flujos más bajos, deben tenerse en cuenta las propiedades inherentes a la interacción entre los neutrones y los núcleos de la muestra16. La longitud de dispersión de los neutrones difiere para los isótopos del mismo elemento, una propiedad que puede explotarse ventajosamente en la dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS) para enmascarar o resaltar regiones de una muestra, un proceso conocido como coincidencia de contraste17. En experimentos de difracción, la longitud de dispersión de neutrones coherente negativa de H (-3.741 fm para 1H) puede conducir a la cancelación de las características del mapa de densidad de dispersión de neutrones ya que las longitudes de dispersión de neutrones coherentes de otros átomos biológicamente relevantes, incluido el carbono (6.6511 fm para 12C), nitrógeno (9.37 fm para 14N), oxígeno (5.803 fm para 16O), fósforo (5.13 fm para 31P) y azufre (2.804 fm para 32S), son positivos (Tabla 1)12,14. Además, la gran longitud de dispersión incoherente de H (25.274 fm), aumenta el fondo durante la recopilación de datos, obstaculizando la calidad del conjunto de datos y comprometiendo la resolución de los datos7. Para eludir estas limitaciones introducidas por H es necesario, para la difracción de neutrones, intercambiar H por su isótopo deuterio, 2H(D), que tiene una longitud de dispersión de neutrones coherente positiva (6.671 fm) y una longitud de dispersión incoherente significativamente menor (4.04 fm)19. Esto se puede lograr mediante perdeuteración, un proceso en el que la proteína es expresada por organismos cultivados en medios totalmente deuterados asegurando la incorporación completa de D en los sitios H20. También es posible deuterar parcialmente la proteína reemplazando H con D únicamente en los sitios intercambiables (grupos titulables) mientras que los sitios no intercambiables unidos al carbono permanecen hidrogenados21. Esto se puede lograr mediante el crecimiento de cristales de proteína hidrogenada en licor madre deuterado22. Sin embargo, lo más común es que el intercambio H/D de proteínas hidrogenadas se realice mediante el intercambio de vapor después del crecimiento de cristales adecuadamente grandes en tampón basado en H2O23. En tales casos, los cristales se montan en un capilar de cuarzo y se equilibran con vapor con un licor madre a base de D20.
Los flujos de neutrones limitados en las fuentes de neutrones dan como resultado tiempos de recopilación de datos más largos, que van desde días hasta varias semanas24. En ORNL, tanto IMAGINE como MaNDi emplean un paso de banda de longitud de onda estrecha en el rango de 2 a 6 Å para optimizar la recopilación de datos25. Los datos se pueden recopilar a temperatura ambiente o a criotemperatura. La recopilación de criodatos puede mejorar potencialmente la calidad de los datos y abre la posibilidad de congelar los intermedios catalíticos. Tras la recopilación de datos de difracción de neutrones, normalmente se recopila un conjunto de datos de rayos X en el mismo cristal a la misma temperatura o en un cristal cultivado en condiciones idénticas26. La recolección de datos a la misma temperatura permite realizar un refinamiento de la estructura contra datos de rayos X y neutrones, evitando cualquier artefacto potencial inducido por la temperatura, como cambios en la visibilidad y posición de las aguas o la ocupación de residuos con conformaciones alternativas27. El refinamiento conjunto de los datos de neutrones de rayos X aumenta la relación datos-parámetro y proporciona la ventaja de permitir que las coordenadas de la columna vertebral de la proteína se refinen contra los datos de rayos X, mientras que los datos de difracción de neutrones se utilizan para refinar la posición de los átomos H/D28. Esto es particularmente útil cuando se utilizan muestras parcialmente deuteradas, donde la cancelación de densidad debido a los átomos de H en sitios no intercambiables en la proteína está presente. Aunque el número de estructuras de rayos X supera con creces el número de estructuras de neutrones depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), los paquetes de software diseñados inicialmente para el refinamiento de los datos de rayos X se han ampliado para abarcar también los datos de neutrones3,29,30. Después de la recopilación de datos, los modelos se pueden refinar utilizando paquetes de refinamiento como phenix.refine, CNSsolve (nCNS) o SHELXL28,31,32,33. Durante el proceso de refinamiento, se pueden visualizar mapas de densidad de dispersión de neutrones para su ajuste manual utilizando COOT34. Siguiendo la solución de estructura, las coordenadas y los archivos de datos de difracción de neutrones y/o rayos X pueden enviarse al PDB, quien validará y depositará el modelo, poniéndolo a disposición del público18,29,30.
El análisis estructural de proteínas es un enfoque multifacético en el que se utilizan numerosas técnicas para sondear su función y mecanismo35. La cristalografía de proteínas de neutrones proporciona información química valiosa para ampliar y complementar los hallazgos de estudios adicionales como la difracción de rayos X, la espectroscopia, la resonancia magnética nuclear (RMN) o la difracción de electrones microcristalinos (microED)36. La difracción de proteínas de neutrones está en una posición única para proporcionar información sobre los mecanismos enzimáticos, ya que los átomos de H son fundamentales para su química. La ausencia de daño por radiación inducido por neutrones los convierte en una sonda excepcionalmente adecuada para el estudio de las metaloproteínas37. Presentamos aquí un ejemplo representativo del proceso de difracción de proteínas neutrónicas desde la preparación de la muestra hasta la recolección, refinamiento y análisis de datos (Figura 1). Se han cultivado cristales de tamaño suficiente para experimentos de difracción de neutrones de la metaloproteína Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D es una metaloproteína que contiene cobre implicada en la degradación de la celulosa recalcitrante por inserción de átomos de oxígeno en el enlace glicosídico38,39. El sitio activo NcLPMO9D contiene un centro de cobre mononuclear dentro de un característico “histidina-brace” compuesto por la histidina N-terminal y una segunda histidina conservada (Figura suplementaria 3)40. El N-terminal de los LPMOs fúngicos está metilado, pero la modificación post-transicional no ocurre durante la expresión recombinante en la levadura. En el estado de reposo De NcLPMO9D, el centro de cobre está presente en un estado de oxidación Cu2+ y se activa mediante la reducción de un solo electrón a Cu1+, permitiendo que el oxígeno molecular se una y se active al reducirse rápidamente a una especie de superóxido41,42. La reacción global de NcLPMO9D requiere la adición adicional de un electrón y dos protones para formar el producto polisacárido hidroxilado43. No se ha identificado la identidad de las especies de oxígeno activado responsables de la extracción del átomo de hidrógeno (HAA) del sustrato polisacárido y actualmente se están realizando estudios estructurales y computacionales intensivos44,45. Dada la química redox en el sitio activo de NcLPMO9D, la mitigación del daño por radiación es particularmente pertinente. Ilustramos aquí la recolección de datos de temperatura ambiente y criotemperatura en cristales NcLPMO9D para determinar la estructura NcLPMO9D en el estado de reposo y en la forma reducida activada, respectivamente46. Se hará hincapié en el montaje de cristales de proteínas, la configuración del instrumento de línea de haz para la recopilación de datos, la preparación de los archivos de datos y coordenadas y los pasos de refinamiento necesarios para modelar una estructura de neutrones de todos los átomos.
La cristalografía de proteínas de neutrones es una técnica altamente sensible para sondear los estados de protonación y la orientación de la molécula de agua en las proteínas. Esta información arroja luz sobre los mecanismos catalíticos de las proteínas, ya que los cambios en la protonación y las interacciones de enlace de hidrógeno a menudo son fundamentales para la química enzimática10. La cristalografía de proteínas de neutrones, aunque es una técnica informativa, tiene una serie de factores que deben tenerse en cuenta antes de planificar la realización de un experimento de difracción de neutrones, a saber:
La cristalografía de proteínas de neutrones es una técnica de flujo limitado. A diferencia de los conjuntos de datos de difracción de rayos X, se esperan factores R más altos y menor integridad, redundancia y relaciones señal-ruido para los conjuntos de datos de neutrones debido a las limitaciones inherentes a la técnica (flujo limitado, cuasi-Laue, longitudes de onda más largas). La recopilación de datos de un solo fotograma suele ser de 12 a 18 horas. El éxito de un experimento depende en gran medida del tamaño y la calidad de la muestra, siendo cristales de 0,1 mm3 a menudo el requisito mínimo3. La difracción de neutrones requiere la producción de grandes cantidades de proteínas para establecer gotas de cristalización que van desde 10 a 800 μL. El volumen mínimo para cultivar cristales suficientemente grandes se puede estimar utilizando una calculadora de volumen dados los parámetros de cristal y muestra (https://neutrons.ornl.gov/imagine). El crecimiento de cristales grandes se ha logrado con mayor frecuencia por difusión de vapor3. La cristalización de gotas colgantes permite el crecimiento de cristales en grandes gotas que van desde 10-25 μL, mientras que las gotas más grandes que van hasta ~ 50 μL se pueden configurar utilizando equipos de caída sentada disponibles comercialmente14,54. Las placas de vidrio siliconadas de nueve pocillos se pueden usar para configurar gotas muy grandes, con volúmenes de hasta 800 μL. Estas placas de vidrio se colocan en “cajas de sándwich” disponibles comercialmente en Hampton Research. Otras técnicas de cristalización incluyen la cristalización por lotes, en la que el límite del tamaño de la gota es dictado por el recipiente. La configuración del experimento de cristalización por lotes puede variar desde microlitros hasta mililitros55. La cristalización también se puede realizar mediante la técnica de diálisis en la que la proteína se equilibra con el precipitante a través de una membrana de diálisis o por contradifusión a lo largo de un gradiente de concentración de precipitantes o a través de un tapón poroso como la agarosa56,57. La siembra ofrece otra alternativa para obtener cristales del volumen deseado. La micro y macrosiembra se han empleado con éxito para el crecimiento de grandes cristales, incluido el cristal grande de NcLPMO9D45. Algunos conocimientos del diagrama de fases de proteínas, incluida la influencia de la temperatura en la solubilidad, ayudan en el crecimiento de grandes cristales.
Al planificar un experimento de difracción de neutrones, la optimización de la preparación de proteínas para maximizar la relación señal-ruido durante la recopilación de datos de difracción es esencial7. Para eludir la cancelación de densidad y la alta dispersión incoherente causada por los átomos de H, los mapas SLD de neutrones se pueden mejorar intercambiando átomos de H por su isótopo D, que posee una longitud de dispersión coherente positiva y una longitud de dispersión incoherente baja. Para lograr esto, se realiza el intercambio de vapor del cristal de proteína hidrogenada contra el tampón de cristalización deuterado. Esto asegura el intercambio H/D de moléculas de disolvente y los átomos de proteína H lábiles y titulables23. El intercambio de vapor se realiza montando el cristal hidrogenado en un capilar de cuarzo con “tapones” tampón de cristalización deuterados basados en D2O y representa una técnica efectiva y suave que se aplica con mayor frecuencia14,23,35. El intercambio puede tardar varias semanas y preferiblemente requiere que el búfer deuterado se cambie con frecuencia para garantizar el máximo intercambio H / D. El intercambio H/D también se puede realizar remojando directamente el cristal en tampón deuterado. Para evitar colocar el cristal bajo estrés debido a la exposición a D2O, el proceso de remojo debe realizarse gradualmente aumentando gradualmente la relación D2O: H2O58. Además de esto, la cristalización de proteínas hidrogenadas también se puede realizar en tampón deuterado para el intercambio de H/D en sitios H lábiles22,59. Cabe señalar, sin embargo, que el tampón basado en D2O tiene un efecto sobre la solubilidad de la proteína que requiere un ajuste adicional de las condiciones conocidas basadas en H2O3,59. También se ha observado que los tampones basados en D2O conducen a cristales más pequeños en algunos casos59. El intercambio completo de átomos de H titulables y unidos al carbono a D se puede lograr expresando proteínas en medios deuterados para generar una muestra perdeuterada20. Los mapas SLD de neutrones resultantes de la muestra perdeuterada se mejorarán significativamente, ya no mostrando la cancelación de densidad de la contraparte de la muestra hidrogenada. Esto es beneficioso cuando se caracteriza H/D unido en sitios no intercambiables en una proteína o cofactor. Sin embargo, la expresión de proteína perdeuterada es a la vez alta en costo y baja en rendimiento60. El Centro de Biología Molecular Estructural (CSMB) del Laboratorio Nacional de Oak Ridge (ORNL) ofrece una instalación de deuteración para los usuarios que buscan generar una muestra perdeuterada (https://www.ornl.gov/facility/csmb). La expresión perdeuterada se realiza típicamente en un biorreactor en la escala de 1 L que produce ~ 50 mg de proteína purificada61.
Después de la recopilación de datos de difracción de neutrones, se realiza el refinamiento y la construcción de modelos interactivos. El refinamiento se puede ejecutar utilizando múltiples suites de software, incluyendo phenix.refine, nCNS o SHELXL28,31,32,33. La suite Phenix es el software más utilizado para el refinamiento de los datos de difracción de neutrones junto con Coot, que se utiliza para construir manualmente el modelo a partir de los mapas SLD de neutrones34. Aunque tanto Phenix como Coot permiten el procesamiento de datos de difracción de neutrones, pueden carecer de ciertas características necesarias para procesar la idiosincrasia asociada con los datos de neutrones y las muestras deuteradas. Por ejemplo, Coot no contiene optimización geométrica para residuos deuterados, lo que puede provocar complicaciones durante la construcción del modelo, ya que la función “Real Space Refine” da como resultado residuos “explosivos” (Figura suplementaria 26)62. Esto se puede resolver generando archivos de retención para todos los residuos deuterados. Sin embargo, este es un proceso intensivo y tales bibliotecas no están actualmente disponibles públicamente. Al realizar refinamientos en Phenix, los sitios H / D intercambiables se establecerán inicialmente en 0.50 de ocupación para H y D. A medida que se realicen refinamientos, la ocupación de H y D se refinará de acuerdo con los mapas SLD de neutrones. Durante la construcción interactiva de modelos, los mapas Fo-Fc de densidad de diferencia son muy informativos para evaluar las ocupaciones H / D. Los mapas se pueden utilizar para determinar qué sitios poseen una alta ocupación D, lo que es particularmente informativo en el sitio activo donde los estados de protonación son catalíticamente relevantes63. Las situaciones ambiguas surgen, sin embargo, cuando el H:D la ocupación es cercana a 0.70:0.30, lo que resulta en la cancelación completa de la señal en los mapas SLD de neutrones64. También debe tenerse en cuenta que los conjuntos de datos de neutrones cuasi-Laue a menudo tienen una completitud de alrededor del 80%, que es inferior a la observada rutinariamente ≥ 98% para los datos de difracción de rayos X. Al refinar los datos de difracción de neutrones en Phenix, las amplitudes observadas faltantes (Fo) se calculan a partir del modelo para completar la lista de reflexión, introduciendo así el sesgo del modelo. Para tener en cuenta este posible sesgo, los mapas “no_fill” deben examinarse durante la construcción de modelos interactivos en lugar de los mapas “llenos”.
Los usuarios pueden optar por realizar un refinamiento conjunto de datos de rayos X / neutrones de su estructura, o un refinamiento de datos de neutrones solamente. Visualizar mapas SLD de neutrones, particularmente a menor resolución, puede ser inicialmente desconcertante, especialmente para una proteína hidrogenada en la que H todavía está presente en sitios no intercambiables a pesar del intercambio de vapor H / D. Esto da lugar a cancelaciones de mapas de densidad de neutrones, dando la impresión de mapas discontinuos65,66. La recopilación de un conjunto de datos de rayos X correspondiente complementa ventajosamente estas cancelaciones en un refinamiento conjunto (Figura 13A y Figura 13B). Una estrategia de refinamiento conjunto generalmente implica refinar las coordenadas de la columna vertebral de la proteína contra los datos de rayos X, mientras que los datos de difracción de neutrones se utilizan para refinar la posición y ocupación de los átomos de H / D en sitios intercambiables28. Dado que la introducción de la ocupación conjunta de H/D en sitios intercambiables aumenta el número de parámetros que se refinan, un refinamiento conjunto con datos de rayos X también aumenta la relación datos-parámetro. Un refinamiento conjunto requiere que se recolecte un conjunto de datos de rayos X correspondiente a la misma temperatura en el mismo cristal o en un cristal cultivado en las mismas condiciones. Para los datos de difracción de neutrones recopilados a temperatura ambiente (300K), el conjunto de datos de rayos X correspondiente debe recopilarse a temperatura ambiente utilizando una estrategia de recopilación de datos de dosis baja para limitar el daño por radiación. Las muestras perdeuteradas, por el contrario, proporcionan mapas SLD de neutrones mejorados y continuos, ya que no poseen la misma magnitud de cancelación de señal H / D. Sin embargo, la longitud de dispersión de neutrones de ciertos elementos, incluidos los metales y el azufre, los hace poco visibles en los mapas SLD de neutrones, incluso si la proteína ha sido perdeuterada (Figura 13C-F)18. Si un metal necesita ser caracterizado, es mejor utilizar la difracción de rayos X en un refinamiento conjunto o aplicar técnicas espectroscópicas para complementar los experimentos de difracción. Los refinamientos de datos solo con neutrones a menudo se realizan cuando el conjunto de datos de neutrones tiene alta resolución o si se utilizó una proteína perdeuterada. Además, el refinamiento de los datos de solo neutrones es particularmente útil si se está estudiando una proteína altamente sensible al daño por radiación, ya que una estructura derivada de rayos X puede poseer artefactos inducidos por radiación. Si se va a realizar un refinamiento de solo datos de neutrones, se debe determinar si el conjunto de datos de neutrones correspondiente tiene suficiente integridad y resolución.
ORNL ofrece dos instalaciones para la recopilación de datos de difracción de neutrones: la línea de haz IMAGINE en el HFIR, así como la línea de haz MaNDi en el SNS36,67. Si bien ambos instrumentos proporcionan medios efectivos para recopilar un conjunto de datos de difracción de neutrones que emplea principios similares, cada instrumento tiene especificaciones únicas que deben tenerse en cuenta al solicitar el tiempo de haz. IMAGINE recopila datos cuasi-Laue y está optimizado para la recopilación de datos a temperatura ambiente en cristales con celdas unitarias de hasta ~ 100 Å. MaNDi se puede utilizar para la recopilación de datos de temperatura ambiente y criotemperatura empleando la recolección TOF-Laue en cristales con celdas unitarias de hasta ~ 300 Å. Antes de recopilar un conjunto de datos completo, se realiza una prueba en el cristal para evaluar la calidad del patrón de difracción obtenido en el que el cristal se expone al haz de neutrones durante un solo marco. Si el cristal es de calidad suficiente, se recopilará, indexará, integrará, escalará y fusionará un conjunto de datos completos de difracción de neutrones en un proceso análogo al procesamiento de datos de rayos X. IMAGINE hace uso de Lauegen y Lscale y MaNDi utiliza el paquete Mantid y emplea el ajuste de perfiles tridimensionales48,50,51,68,69,70. A los científicos que se conviertan en usuarios de cualquiera de estas instalaciones se les proporcionará un conjunto de datos en formato MTZ o HKL para su posterior análisis.
La difracción de neutrones es una técnica no destructiva y altamente sensible para sondear el estado de protonación y las interacciones de enlaces de hidrógeno de macromoléculas biológicas. Es particularmente útil para proteínas fotosensibles y metaloproteínas. Se deben tener en cuenta varias consideraciones con respecto a la técnica, así como el procesamiento de los datos antes de realizar un experimento, sin embargo, el resultado arroja resultados que pueden dar una visión valiosa del mecanismo catalítico de la proteína de interés. La cristalografía de proteínas de neutrones complementa los estudios computacionales, estructurales, bioquímicos y espectroscópicos, lo que la convierte en una herramienta valiosa en la caja de herramientas del biólogo de técnicas utilizadas para caracterizar macromoléculas biológicas.
The authors have nothing to disclose.
Los experimentos de expresión, purificación y cristalización de proteínas se llevaron a cabo en el Centro de Biología Molecular Estructural (CSMB), una instalación de usuario de investigación biológica y ambiental del Departamento de Energía de los Estados Unidos en el Laboratorio Nacional de Oak Ridge. Los datos de difracción de neutrones se recopilaron en BL-11B MaNDi en la Fuente de Neutrones de Espalación (SNS) en ORNL, que está patrocinada por la División de Instalaciones de Usuarios Científicos, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía, Departamento de Energía de los Estados Unidos. Los autores agradecen a Brendan Sullivan por su ayuda con la reducción de datos. Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en las instalaciones del Centro de Innovación de Educación, Tecnología e Investigación Molecular (METRIC) de la Universidad Estatal de Carolina del Norte, que cuenta con el apoyo del Estado de Carolina del Norte. GCS reconoce el apoyo en parte de la Fundación Nacional de Investigación (NRF), Sudáfrica y el programa de Oportunidades para Graduados (GO!) en ORNL. FM reconoce el apoyo de USDA NIFA Hatch 211001.
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length | DiaDent/DiaVet | 218-292 | |
Capillary wax | Hampton | HR4-328 | |
CCP4 | Version 7.0.077 | ||
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | CLS430790 | |
Conical Centrifuge Tubes (50mL) | Corning | CLS430828 | |
Coot | Version 0.8.9.2 | ||
CrystalCap ALS | Hampton | HR4-779 | |
Curved-Tip Forceps | Mitegen | TW-CTF-1 | |
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
Deuterium oxide 99.9 atom % D | Sigma-Aldrich | 151882 | |
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm | Mitegen | M5-L18SP-1000 | |
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit | Mettler Toledo | 30266626 | |
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml | Spearlab | M-FD-800 | |
Four Color Mounting Clay | Hampton | HR4-326 | |
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), | Sigma-Aldrich | 54457 | |
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector | Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris | XtaLAB Synergy-R | Home source X-ray diffractometer |
Magnetic Wand Straight | Mitegen | M-R-1013198 | |
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) | Eppendorf | 930001007 | |
Microtubes volume 1.5 mL | Eppendorf | Z606340 | |
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter | Fischerbrand | FB0875713 | |
Phenix | Version 1.14-3260 | ||
Pin Tong 18 mm | Mitegen | M-R-1013196 | |
Pipette Volume 0.1-2.5 μL | Eppendorf Research | Z683779 | |
Pipette Volume 100-1000 μL | Eppendorf Research | Z683825 | |
Pipette Volume 10-100 μL | Eppendorf Research | Z683809 | |
Pipette Volume 20-200 μL | Eppendorf Research | Z683817 | |
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length | Hampton | HR6-146 | Thin-walled capillary |
Research Stereomicroscope System | Olympus | SZX16 | |
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases | Mitegen | GB-B3-R | |
Round – Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length | VitroCom | CV1012 | Thick-walled capillary |
Sandwich Box with cover | Hampton | HR3-132 | |
Siliconized 9 Well Glass Plate | Hampton | HR3-134 | |
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) | Mitegen | XQ-P-24S-A | |
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D | Sigma-Aldrich | 176788 | |
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) | Hampton | HR3-247 | |
Universal Pipet Tips, 0.1 – 10 µL | VWR | 76322-528 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 100 µL | VWR | 76322-136 | |
Universal Pipet Tips, 100 – 1000 µL | VWR | 76322-154 | |
Universal Pipet Tips, 20 – 200 µL | VWR | 76322-150 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 20 µL | VWR | 76322-134 | |
Wax pen | Hampton | HR4-342 |