概要

Isolamento e Análise de Lipoproteínas plasmáticas por Ultracentrifugação

Published: January 28, 2021
doi:

概要

Vários métodos têm sido utilizados para analisar lipoproteínas plasmáticas; no entanto, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Aqui, descrevemos um método sobre como isolar as lipoproteínas do plasma usando ultracentrifugação de densidade sequencial e como analisar as apolipoproteínas para fins diagnósticos e de pesquisa.

Abstract

A análise de lipoproteínas plasmáticas e apolipoproteínas é parte essencial para o diagnóstico de dislipidemia e estudos de metabolismo lipídico e aterosclerose. Embora existam vários métodos para analisar lipoproteínas plasmáticas, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Devido ao seu procedimento de separação intacto, as frações de lipoproteína isoladas por este método podem ser utilizadas para análise de lipoproteínas, apolipoproteínas, proteomes e estudo funcional de lipoproteínas com células cultivadas in vitro. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para isolar sete frações de lipoproteína, incluindo VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10, e 1,21 g/mL) do plasma de coelho usando ultracentrifugação flutuante sequencial. Além disso, apresentamos aos leitores como analisar apolipoproteínas como apoA-I, apoB e apoE por SDS-PAGE e mancha ocidental e mostrar resultados representativos de perfis de lipoproteína e apolipoproteína usando modelos de coelho hiperlipidêmica. Este método pode se tornar um protocolo padrão tanto para médicos quanto cientistas básicos analisarem as funções de lipoproteína.

Introduction

A dislipidemia é o principal fator de risco da doença aterosclerótica no mundo. Altos níveis de lipoproteínas de baixa densidade (LDLs) e baixos níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDLs) estão intimamente associados a um alto risco de doença cardíaca coronariana (CHD)1,2. No cenário clínico, tanto o LDL-colesterol (LDL-C) quanto o HDL-colesterol (HDL-C) são medidos rotineiramente usando um analisador automatizado em um laboratório clínico3,4. Apesar disso, é essencial analisar os perfis de lipoproteína em detalhes para o diagnóstico de dislipidemia e o estudo do metabolismo lipídico e da aterosclerose em animais humanos e experimentais. Vários métodos foram relatados para analisar lipoproteínas plasmáticas, como ultracentrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho [cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)], eletrofose por géis de agarose e poliacrilamida, ressonância magnética nuclear e precipitação química seletiva usando polianões e cára divalentes ou outros produtos químicos. Na década de 1950, o grupo de Havel propôs pela primeira vez o conceito de lipoproteínas definidas por densidades usando ultracentrifugação e as classificou em chylomicrons (CM), lipoproteínas de baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de densidade intermediária (IDL), LDL e HDL5 e posteriormente, o método foi modificado por outros grupos6,7. Até agora, a ultracentrifugação é o método mais popular e confiável, enquanto o protocolo prático ainda não está disponível. Neste artigo, tentamos descrever um protocolo fácil de usar para isolar uma pequena escala de plasma usando ultracentrifugação flutuante de densidade sequencial originalmente descrita anteriormente8. Isolamento de sete frações de lipoproteína plasmáticas [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1.10, e 1,21 g/mL)] permite que os pesquisadores façam uma análise extensiva das lipoproteínas e suas apolipoproteínas composicionais9,10,11. As sete lipoproteínas de densidade consecutiva podem ser usadas para analisar funções de lipoproteína e também servir para estratégias in vitro baseadas em células. Este protocolo deve ser útil tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa básica. Aqui usamos o plasma de coelho como exemplo para demonstrar essa técnica, enquanto o plasma de outras espécies pode ser aplicado da mesma forma.

Protocol

Todos os procedimentos para estudos de coelhos foram realizados com aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yamanashi (número aprovado: A28-39). 1. Separação de plasma do sangue de coelho Prepare microtubos de 1,5 mL contendo 15 μL de 0,5 M EDTA (pH 8.0) para coleta de sangue. Coloque um coelho em um contidor e perfure uma artéria intermediária auricular usando uma agulha calibre 22 e colete sangue em um tubo. Misture o san…

Representative Results

Usando este protocolo, isolamos lipoproteínas de coelho usando 1 mL de plasma e obtivemos sete frações de densidade. Frações de densidade isolada são suficientes para medir lipídios e apolipoproteínas, como descrito acima para a maioria dos propósitos de pesquisa. O mesmo procedimento também pode ser usado para isolar lipoproteínas plasmáticas de espécies humanas e outras. Para animais de pequeno porte, como ratos, é necessário plasma agrupado. A Figura 3 mostra perfis de lipo…

Discussion

A hiperlipidemia é um dos fatores de risco mais importantes da doença aterosclerótica. Assim, a análise de lipoproteínas plasmáticas não é apenas essencial para o diagnóstico de pacientes com dislipidemia, mas também importante para a investigação de mecanismos moleculares de metabolismo de lipoproteína e aterosclerose. Neste estudo, descrevemos o protocolo de isolamento e análise de lipoproteínas plasmáticas que podem ser aplicadas nos laboratórios onde a ultracentrifugação está disponível. As infor…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa do JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, a National Natural Science Foundation of China (nº 81941001 e 81770457), JSPS-CAS sob o Programa Cooperativo de Pesquisa Japão-China.

Materials

22-gauge needle Terumo NN-2232S For blood collection
96-well microplate greiner bio-one 655101 For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody LifeSpan BioSciences LS-C314186 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody ROCKLAND 600-101-111 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody Merck Millipore AB947 For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 299-50101 For apolipoprotein analysis
Centrifuge HITACHI himac CF15RN
Closure Spectrum 132736 For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing FUJIFILM Wako Pure Chemical 043-30921 For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block Major Science MD-01N For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 For Western blotting
Electrophoresis Chamber BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate FUJIFILM Wako Pure Chemical 345-01865 For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper ADVANTEC 590 For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor BECKMAN COULTER 357656 TLA-120.2
Fixing solution For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane BIO-RAD 1620177 For Western blotting
Lumino image analyzer GE Healthcare For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer ADVANTEC SR-304 For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK BIO-RAD For lipids measurment
Microtube INA-OPTIKA SC-0150
Orbital agitator USBDbo Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody Jackson ImmunoResearch 705-035-003 For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 715-035-150 For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 433-36201 For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes BECKMAN COULTER 343778
Potassium Bromide FUJIFILM Wako Pure Chemical 168-03475 For density solution
Power Supply BIO-RAD For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra BIO-RAD 161-0377 For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer Natsume Seisakusho KN-318 For blood collection
Rotor HITACHI T15A43
SDS-PAGE running buffer 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x) 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel 4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder FUJIFILM Wako Pure Chemical 190-12865 For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 439-17501 For lipids measurment
Triglyicerides assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 432-40201 For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube BECKMAN COULTER 347960 For lipoprotein isolation
Tween 20 SIGMA-ALDRICH P1379 For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER A95761 Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell

参考文献

  1. Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
  2. Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
  3. Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
  4. Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
  5. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
  6. Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
  7. Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
  8. Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
  9. Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
  10. Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
  11. Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
  12. Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
  13. Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
  14. Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
  15. Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
  16. von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
  17. Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
  18. Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
  19. De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
  20. Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).

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記事を引用
Niimi, M., Yan, H., Chen, Y., Wang, Y., Fan, J. Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation. J. Vis. Exp. (167), e61790, doi:10.3791/61790 (2021).

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