כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לדמיין מתאם מרחבי של פפטיד הקשורות לגנים קלציטונין (CGRP)-אימונואקטיבי סיבי עצב וכלי דם ב דורה גולגולתי mater באמצעות immunofluorescence והיסטוכימיה פלואורסצנטית עם CGRP ו phalloidin, בהתאמה. בנוסף, מקורם של סיבי עצב אלה היה מדרדר נעוצים במעקב עצבי פלואורסצנטי.
מטרת מחקר זה הייתה לבחון את ההתפלגות והמקור של פפטיד הקשורות לגנים קלציטונין (CGRP)-אימונואקטיבי סיבי עצב חושיים של דורה דורה גולגולתית באמצעות immunofluorescence, תלת מימדי (3D) שחזור טכניקת מעקב מדרדר. כאן, סיבי העצב וכלי הדם היו מוכתמים באמצעות כשל חיסוני וטכניקות היסטוכימיה עם CGRP ופאלואידין פלואורסצנטי, בהתאמה. המתאם המרחבי של סיבי עצב CGRP-immuoreactive dural וכלי דם הוכחו על ידי שחזור 3D. בינתיים, המקור של סיבי העצבים CGRP-immunoreactive זוהו על ידי טכניקת מעקב עצבי עם fluorogold (FG) מהאזור סביב עורק קרום המוח האמצעי (MMA) ב דורה גולגולתי מאטר כדי גנגליון trigeminal (TG) וצוואר הרחם (C) גרעיני שורש הגב (DRGs). בנוסף, המאפיינים הכימיים של נוירונים עם תווית FG ב- TG ו- DRGs נבדקו גם יחד עם CGRP באמצעות immunofluorescences כפול. תוך ניצול דגימת ההרה כולה השקופה ושחזור תלת-ממדי, הוכח כי סיבי עצב CGRP-immunoreactive ועורקים עם תווית פאלודין פועלים יחד או יוצרים בנפרד רשת נוירו-וסקולרית דוראלית בתצוגה תלת-ממדית, בעוד נוירונים FG שכותרתו נמצאו בענפים עיניים, maxillary, ו mandibular של TG, כמו גם C2-3 DRGs ipsilateral לצד של יישום מעקב שבו חלק נוירונים FG שכותרתו הציג עם ביטוי CGRP-immunoreactive. עם גישות אלה, הדגמנו את המאפיינים ההפצתיים של סיבי עצב CGRP-immunoreactive סביב כלי הדם ב דורה גולגולתי מאטר, כמו גם את המקור של סיבי עצב אלה מ TG ו DRGs. מנקודת המבט של המתודולוגיה, זה עשוי לספק התייחסות חשובה להבנת המבנה המוחי המסובך של דורה גולגולתי מאטר תחת המצב הפיזיולוגי או הפתולוגי.
ה דורה מאטר גולגולתי הוא השכבה החיצונית ביותר של קרום המוח כדי להגן על המוח ומכיל כלי דם בשפע וסוגים שונים של סיבי עצב1,2. מחקרים רבים הראו כי דורה דורה גולגולתית רגישה עשויה להיות הגורם העיקרי המוביל להתרחשות של כאבי ראש, מעורבים vasodilation חריגה innervation3,4,5. לכן, הידע של מבנה neurovascular ב דורה הגולגולתי mater חשוב להבנת הפתוגנזה של כאבי ראש, במיוחד עבור מיגרנה.
למרות innervation דורה נחקרה בעבר עם אימונוהיסטוכימיה קונבנציונאלי, המתאם המרחבי של סיבי עצב וכלי דם ב דורה גולגולתי מאטר נחקרו פחות6,7,8,9. על מנת לחשוף את המבנה הנוירו-וסקולרי הדוראלי ביתר פירוט, פפטיד הקשור לגנים קלציטונין (CGRP) ופאלואידין נבחרו כסמנים להכתמת סיבי העצבים וכלי הדם של דוראלי בכל הר דורה גולגולתי עם כשל חיסוני והיסטוכימיה פלואורסצנטית10. זה עשוי להיות בחירה אופטימלית כדי לקבל תצוגה תלת מימדית (3D) של מבנה neurovascular. בנוסף, fluorogold (FG) יושם על האזור סביב עורק קרום המוח האמצעי (MMA) ב dura הגולגולתי מאטר כדי לקבוע את המקור של סיבי עצב CGRP-immunoreactive, ועקבות גנגליון trigeminal (TG) וצוואר הרחם (C) שורש הגב הגרעיני (DRGs), בעוד נוירונים FG שכותרתו נבדקו יחד עם CGRP באמצעות immunofluscence.
מטרת מחקר זה הייתה לספק כלי יעיל לחקירת המבנה המוחי בדורה הגולגולתי עבור innervation CGRP-immunoreactive ומקורו. על ידי ניצול היתרון של הר דורה מאטר שקוף כולו ושילוב של immunofluorescence, מעקב מדרדר, טכניקות confocal, ושחזור 3D, ציפינו להציג תצוגה תלת-ממדית חדשנית של המבנה הנוירו-וסקולרי בדורה מאטר הגולגולתי. גישות מתודולוגיות אלה עשויות לשמש עוד יותר לחקר הפתוגנזה של כאבי ראש שונים.
במחקר זה, הדגמנו בהצלחה את ההתפלגות ואת המקור של סיבי עצב CGRP-immunoreactive בדורא מאטר הגולגולתי באמצעות immunofluorescence, שחזור תלת מימדי וגישות מעקב עצבי עם נוגדן CGRP ומעקב עצבי FG, מתן ראיות היסטולוגיות וכימיות כדי להבין טוב יותר את הרשת neurovascular dural.
כפי שהיה ידוע, CGRP ממלא תפקיד קריטי בפתו…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי הפרויקט של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (קוד פרויקט מס ‘ 2019YFC1709103; מס ‘ 2018YFC1707804) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (קוד פרויקט מס ‘ 81774211; מס ‘ 81774432; מס ‘ 81801561).
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |