Dit manuscript beschrijft een protocol voor neutronenradiografie en computertomografie van biologische monsters met behulp van een High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D-bundellijn om een metalen implantaat in een rattendijbeen, een muizenlong en een kruidachtig plantenwortel / bodemsysteem te meten.
Neutronen zijn van oudsher gebruikt voor een breed scala aan biologische toepassingen met behulp van technieken zoals neutronenverstrooiing met een kleine hoek, neutronenspinecho, diffractie en inelastische verstrooiing. In tegenstelling tot neutronenverstrooiingstechnieken die informatie verkrijgen in de wederzijdse ruimte, meet op verzwakking gebaseerde neutronenbeeldvorming een signaal in de echte ruimte dat wordt opgelost in de orde van tientallen micrometers. Het principe van neutronenbeeldvorming volgt de wet van Beer-Lambert en is gebaseerd op de meting van de bulk neutronenverzwakking door middel van een monster. Grotere verzwakking wordt getoond door sommige lichte elementen (met name waterstof), die belangrijke componenten zijn van biologische monsters. Contrastmiddelen zoals deuterium, gadolinium of lithiumverbindingen kunnen worden gebruikt om het contrast op dezelfde manier te verbeteren als bij medische beeldvorming, inclusief technieken zoals optische beeldvorming, magnetische resonantiebeeldvorming, röntgenstraling en positronemissietomografie. Voor biologische systemen worden neutronenradiografie en computertomografie in toenemende mate gebruikt om de complexiteit van het ondergrondse plantenwortelnetwerk, de interactie met bodems en de dynamiek van waterflux in situ te onderzoeken. Bovendien zijn pogingen om contrastdetails in diermonsters, zoals zachte weefsels en botten, te begrijpen, onderzocht. Dit manuscript richt zich op de vooruitgang in neutronenbioimaging, zoals monstervoorbereiding, instrumentatie, data-acquisitiestrategie en data-analyse met behulp van de High Flux Isotope Reactor CG-1D neutronenbeeldvormingsbundellijn. De bovengenoemde mogelijkheden zullen worden geïllustreerd aan de hand van een selectie van voorbeelden in de plantenfysiologie (kruidachtige plant/wortel/bodemsysteem) en biomedische toepassingen (rattendij- en muizenlong).
Het principe van neutronenradiografie (nR) is gebaseerd op de verzwakking van neutronen door de materie die ze doorkruisen. In tegenstelling tot röntgenstralen die worden verstrooid door de elektronenwolk van een atoom, kunnen neutronen worden geabsorbeerd of verstrooid door de kern. Neutronen zijn gevoelig voor lichte elementen, zoals waterstof (H), en kunnen bijgevolg worden gebruikt voor radiografische biologische toepassingen zoals dierlijke 1,2,3,4,5,6,7 of menselijke weefsels 8,9 en ondergrondse bodem/wortelsystemen 10,11,12,13,14 ,15. Neutronenbeeldvorming is een aanvullende techniek naast röntgenbeeldvorming, die in staat is om zware elementen te detecteren16,17,18. Op verzwakking gebaseerde nR wordt bepaald door de lineaire verzwakkingscoëfficiënten van de materialen in het monster en door de dikte van het monster, zoals beschreven in de wet van Beer-Lambert, die stelt dat de uitgezonden bundel recht evenredig is met de hoeveelheid materiaal en de padlengte door het materiaal. De transmissie, T, kan dus worden berekend als:
(1)
waarbij I 0 jp I respectievelijk de invallende en uitgezonden bundelintensiteiten zijn; μ en x zijn respectievelijk de lineaire verzwakkingscoëfficiënt en de dikte van een homogeen monster. De μ verzwakkingscoëfficiënt wordt gegeven door:
(2)
waarbij σ de neutronenverzwakkingsdoorsnede van het monster is (zowel verstrooiing als absorptie), ρ de dichtheid, NA het getal van Avogadro en M de molaire massa.
Contrast in radiografie van biologische monsters met behulp van laagenergetische neutronen (d.w.z. energieën onder 0,5 eV) is meestal te wijten aan een verandering in de dichtheid van H (voor een vaste monsterdikte). Dit komt door de waarschijnlijkheid van interactie van een neutron met de H-kern, die groter is dan met andere kernen die aanwezig zijn in biologische monsters, en het feit dat de dichtheid van het H-atoom van het grootste belang is omdat het het meest voorkomende atoom is in biologische monsters.
Sinds de vroege stadia zijn nR- en neutronencomputertomografie (nCT) op grote schaal gebruikt voor materialen en technische toepassingen 19,20,21,22,23. De eerste demonstratie-experimenten van neutronengevoeligheid voor H in biologische monsters begonnen in het midden van de jaren 195024 met de metingen van plantenspecimens. Het werk ging door tot in de jaren 1960 met bijvoorbeeld de radiografie van een menselijke borstkas25 of ratten26, waarin het gebruik van contrastmiddelen, zoals gadoliniumoxide (Gd2O3), werd onderzocht. Bovendien werd verondersteld dat contrast in menselijk tumorweefsel versus normaal weefsel te wijten was aan een lokale toename van het H-gehalte. Tijdens deze eerste proeven werd geconcludeerd dat verhoogde neutronenflux en ruimtelijke resolutie de kwaliteit van nR zouden verbeteren en waarschijnlijk de populariteit ervan als een complementaire techniek voor industriële of biomedische toepassingen zouden vergroten. De meest recente studies omvatten nR- en nCT-metingen uitgevoerd op kankerweefselmonsters1 en secties van dierlijke organen 2,3,27 voor biomedische en forensische toepassingen.
Gelegen in het Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, is de High Flux Isotope Reactor (HFIR) een krachtige neutronenbron die neutronen produceert door splijtingsreactie. Deze neutronen hebben energieën in de orde van grootte van 2 MeV en worden in de reactorpool “gekoeld” door kinetische reacties met zwaar water om energieën in de orde van 100-300 eV te bereiken. De optimalisatie van een neutronenexperiment, of het nu gaat om verstrooiing of beeldvorming, begint met het begrijpen van de neutronenbron en bundellijneigenschappen zoals de bundelintensiteit, energieverdeling en het effect van de achtergrond (snelle neutronen, vertraagde neutronen, gammastralen). In de HFIR-koudgeleidehal waar de beeldbundellijn zich bevindt, worden neutronen verder “gekoeld” door kinetische interacties met een vloeibare H-moderator. Ze worden vervolgens in een gebogen geleidingssysteem weggevoerd van de gezichtslijn van de bron, waardoor snelle neutronen en gammavervuiling worden geëlimineerd. Zoals geïllustreerd in figuur 1, wordt de CG-1D neutronenbeeldbundellijn28,29 op een koude geleider geplaatst, wat impliceert dat het neutronenenergiebereik varieert van enkele meV tot enkele tientallen eV (in dit geval varieert de overeenkomstige bruikbare neutronengolflengte van 0,8 tot 10 Å) met een flux in het bereik van 107 n / (cm2∙s) op de monsterpositie. Een gemotoriseerd diafragma/diffusersysteem definieert de gaatjesgeometrie van het beeldvormende instrument. Neutronen leggen een afstand van 6,59 m af in een met helium (He) gevulde vluchtbuis met aluminium (Al) ramen aan elk uiteinde. Vluchtbuizen worden gebruikt om neutronen te transporteren terwijl de luchtverstrooiing zodanig wordt beperkt dat het verlies in bundelintensiteit minimaal is. Voor de metingen die in dit manuscript worden beschreven, is de diffuser gemaakt van een 1 mm dik 50 nm aluminiumoxide (Al2O3) nanopoeder verpakt in een Al-container. De diffuser vermindert de bundelartefacten afkomstig van de neutronengeleider (die worden vergroot door de pinhole-geometrie van een beeldbundellijn), anders zijn scherpe horizontale en verticale intensiteitsfluctuaties zichtbaar in de röntgenfoto en wordt normalisatie van de gegevens een uitdaging. Voor de hier geïllustreerde experimenten worden neutronen omgezet in licht met behulp van een 25-μm-dik lithium-6 fluoride / zinksulfidefosfor (6LiF / ZnS: Ag).
Collimatie-optimalisatie is afhankelijk van de positie van de sample-to-detector, de vereiste ruimtelijke resolutie en de acquisitietijd. Wanneer het monster zich op een paar cm afstand van de scintillator bevindt, leveren hoge collimaties (L / D boven 800, waarbij L de afstand is tot de opening van het gaatje van diameter, D en de detector) een betere ruimtelijke resolutie op ten koste van neutronenflux. Lage collimatie (L/D onder 800) heeft de voorkeur voor in situ dynamische studies wanneer de tijdsresolutie prevaleert boven de ruimtelijke resolutie. Voor de in dit manuscript beschreven metingen waren L/D en ruimtelijke resolutie respectievelijk ongeveer 355 en 75 μm. De temporele resolutie varieerde op basis van de signaal-ruisverhouding (SNR). Het monster werd zo dicht mogelijk bij de scintillator geplaatst om geometrische vervorming zoals vervaging te verminderen. Translatie- en rotatiefasen zijn beschikbaar om het monster dicht bij de detectoren te plaatsen en computertomografie (CT) uit te voeren. CG-1D biedt drie soorten detectoren: een charge-coupled device (CCD) met 2048 pixels x 2048 pixels met een pixel pitch van 13,5 μm, een wetenschappelijke complementaire metal-oxide semiconductor (sCMOS) detector met 2560 pixels x 2160 pixels met een pixel pitch van 6,5μm, en een micro-channel plate (MCP) detector30,31 met 512 pixels x 512 pixels met een pixelgrootte van 55μm. Verstrooide neutronen worden geabsorbeerd met ~ 5 mm dik boorrubber om de detectorchip te beschermen tegen het zien van neutronen. Deze absorptie genereert gammastralen die kunnen worden gestopt door lood (Pb) dat tussen het boorrubber en de detector wordt geplaatst. Elke detector is geoptimaliseerd voor een ander gezichtsveld (FOV) en ruimtelijke en tijdresoluties. Voor de rat femur en de muis longmetingen werd de CCD-detector gebruikt voor zijn grote FOV-capaciteit (~ 7 cm x 7 cm) en redelijke ruimtelijke resolutie van ongeveer 75μm. De nCT van het plantenwortel/bodemsysteem werd uitgevoerd met de sCMOS, omdat het doel was om zo snel mogelijk nCT’s te verkrijgen ten koste van FOV (die beperkt was tot ~ 5 cm x 4,2 cm); De ruimtelijke resolutie leed er dus duidelijk onder. In deze detectoren worden neutronen omgezet in licht of een alfadeeltje voor detectiedoeleinden. Door het monster om zijn verticale as te draaien en röntgenfoto’s te maken onder opeenvolgende rotatiehoeken kan nCT worden verkregen. Het 3-dimensionale volumetrische gerenderde model van het onderzochte monster wordt verkregen door gebruik te maken van de interne iMARS3D python-gebaseerde Jupyter gefilterde-back-projectie (FBP) notebook, pyMBIR of een commerciële software, allemaal hieronder beschreven.
Ten slotte worden neutronen die geen interactie hebben gehad met het monster of de detector verzameld in een bundelstoppositie op ongeveer 1 m stroomafwaarts van het detectorsysteem om achtergrondgeluid te minimaliseren. De CG-1D balkstop is 0,75 m breed, 0,5 m hoog en 35 mm dik en gemaakt van B4C in epoxy. De bundelstop is versterkt met 10 mm 95% verrijkt lithiumcarbonaat (6 Li2CO3) in een brandwerende epoxy waar de neutronenbundel raakt, met een holte bekleed met 6Li, lood (Pb) en staal dat is ontworpen om de hoge snelheid van secundaire gammastralen te bevatten. De balkstop is direct bevestigd aan de stalen afschermingswand van de balklijn. Een foto van de CG-1D bundellijn is weergegeven in figuur 2.
Drie reconstructiesoftware werd gebruikt om de drie experimentele gegevens respectievelijk in 3D te reconstrueren. De reconstructie van het longmonster van de muis werd uitgevoerd met Octopus32, een commerciële reconstructiesoftware die FBP gebruikt. Octopus-software bevindt zich op een server-pc en kan worden gebruikt om gegevens te reconstrueren die op de beamline zijn verzameld. Een reconstructiesoftware, genaamd iMARS3D, is beschikbaar op CG-1D. Het is gebaseerd op de open source code TomoPY33 met toegevoegde functies zoals geautomatiseerde kantelcorrectie, nabewerkingsfilters, enz. iMARS3D omvat voorbewerking van de gegevens (aftrekken van de achtergrond en ruis), bijsnijden, mediane filtering (om te corrigeren voor gamma-stakingen en dode pixels), geautomatiseerde bestralingsintensiteitsfluctuatiecorrectie en monsterkantelcorrectie. Zodra sinogrammen zijn gemaakt, zijn verdere gegevensverwerking zoals het verwijderen en gladstrijken van ringartefacten een optie. De verschillende stappen van de reconstructie worden opgeslagen op de analyseserver (en later verplaatst in de gedeelde map van het voorstel), terwijl de uiteindelijke 2D-segmenten onmiddellijk worden opgeslagen in de gedeelde map van het voorstel. Het rattendijbeen werd gereconstrueerd met behulp van iMARS3D. Het wortel-/bodemmonster van de plant werd voorbewerkt door mediane filtering van de gegevens met TomoPY, gevolgd door kantelascorrectie met behulp van de SciPy-bibliotheek van Python. De reconstructie werd uitgevoerd met behulp van een python-pakket dat in eigen huis is ontwikkeld met de naam – pyMBIR (gebouwd met behulp van kernels uit de ASTRA-toolbox34) die een reeks tomografische algoritmen implementeert van de baseline FBP tot geavanceerde modelgebaseerde iteratieve reconstructietechnieken35 die hoogwaardige reconstructies kunnen verkrijgen uit extreem schaarse en luidruchtige neutronendatasets. Alle gerenderde volumes op basis van de bovengenoemde reconstructiegereedschappen worden weergegeven in dempingscontrast. Alle visualisatie werd uitgevoerd met behulp van het commerciële visualisatie-, segmentatie- en data-analysesoftwarepakket AMIRA36.
Dit manuscript is bedoeld om de procedure van het gebruik van neutronenbeeldvorming (nR en nCT) op de HFIR CG-1D-bundellijn aan te tonen. Deze studie illustreert ook de huidige state-of-the-art nR- en nCT-mogelijkheden voor biologische monsters, met name een muizenlong, een rattenbot en plantenwortel- / bodemsystemen. De muislong werd gekozen om de complementariteit van neutronen te illustreren om het longweefsel te meten, terwijl röntgenstralen meestal gevoelig zijn voor botten. Het botmonster, een rattendijbeen, had een titanium (Ti) implantaat, wat het contrast tussen het bot en het metaal illustreerde, en de mogelijkheid om het bot / metaal-raakvlak te zien (wat moeilijk te meten is met röntgenstralen omdat metalen ze sterk verzwakken4). Ten slotte illustreert het plant-wortelwatersysteem het driedimensionale (3D) vermogen van nCT om wortel/bodemsystemen in situ te meten. Het toont bovendien de voor- en nadelen van het gebruik van nR voor biologische monsters. Het is duidelijk dat deze methode veilig kan worden gebruikt om de waterdynamiek in een plant-wortelsysteem te meten, maar niet kan worden beschouwd als een levende dierlijke of menselijke beeldvormingstechniek vanwege de risico’s die gepaard gaan met blootstelling aan straling, waardoor studies worden beperkt tot (dode) muizen of pathologie-achtige metingen waarbij bijvoorbeeld een weefselmonster wordt gereseceerd van een patiënt (dier of mens) en bereid door fixatie voordat het wordt gemeten in een neutronenbundel.
Neutronenradiografie en CT van biologische monsters zijn veelbelovende beeldvormingstechnieken die complementair zijn aan röntgenbeeldvorming of magnetische resonantiebeeldvorming. De kritieke stappen bij het uitvoeren van een neutronenbeeldvormingsexperiment van een biologisch monster houden verband met de bereiding en de insluiting ervan aan de bundellijn. Optimalisatie van een experiment wordt gedreven door de wetenschappelijke vraag die beantwoord moet worden. Als de wetenschappelijke vraag een hoge ruimtelijke resolutie vereist om een fenomeen waar te nemen, dan zijn lange acquisitietijden vereist, en het nadeel van nCT (met cm-formaat gezichtsveld) is dat het uren duurt om een scan uit te voeren. Dit is vooral te wijten aan het verschil in totale neutronenflux die beschikbaar is in een reactor in vergelijking met een synchrotronbron, waar röntgen-CT-scans seconden tot minuten kunnen duren voor een gezichtsveld van enkele mm2 . Hoewel de methode kan worden toegepast op ex vivo weefselmonsters die van dieren zijn geëxtraheerd, kan zij niet in vivo worden uitgebreid tot levende dieren of mensen vanwege het risico van blootstelling aan straling (zoals gammastralen geproduceerd door neutronen en neutroneninteracties met de atomen in het monster). Het is echter zeer geschikt voor het in beeld brengen van plantwortel/bodeminteracties (figuur 7), zoals wateropnamedynamiek.
Het voordeel van het gebruik van snelle nCT voor plantdynamica is de gevoeligheid voor H in water en de afwezigheid van stralingsschade aan de plant, in tegenstelling tot röntgen-CT. Bovendien kan een uniek contrast worden waargenomen door het gebruik van neutronen in bot- / metaalmonsters zoals een rattendijbeen waar het metaal relatief transparant is in vergelijking met de omliggende weefsels (figuur 5), waardoor mogelijk metaalartefacten worden vermeden die worden veroorzaakt door röntgen-CT39. Dierlijke weefsels, zoals muizenlongen (figuur 6), vertonen een indrukwekkende detectie van de structuur van zacht weefsel omdat neutronen gevoelig zijn voor H, maar ruimtelijke resolutie is enigszins de beperkende factor in deze metingen. Contrast wordt geleverd door de H-atomen die aanwezig zijn in biologische monsters19,39.
Met de vooruitgang van nieuwe technieken zoals neutronenroosterinterferometrie en de verbetering van de ruimtelijke resolutie (een paar micron is onlangs gemeld42,43) kan neutronenbeeldvorming nog nieuwe contrastmechanismen bieden voor biologische weefsels met een verbeterde ruimtelijke resolutie. De exploratie van neutronen met een hogere energie (om de metingen van dikke monsters mogelijk te maken) belooft ook de mogelijkheid om grotere delen van een dierlijk weefsel zoals een intacte muis te meten, waardoor nog nieuwe mogelijkheden voor biomedisch onderzoek worden geboden.
The authors have nothing to disclose.
Een deel van dit onderzoek maakte gebruik van middelen in de High Flux Isotope Reactor, beheerd door ORNL, en gesponsord door het Amerikaanse ministerie van Energie, Office of Science, User Facilities, onder contract DE-AC05-00OR22725 met UT-Battelle, LLC. Een deel van dit onderzoek werd ondersteund door ORNL via het Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship-programma. Dit onderzoek werd ook gesponsord door het DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research. Rat femorale monsters werden verkregen uit experimenten uitgevoerd in samenwerking met Dr. Rick Sumner in het Rush University Medical Center met financiering verkregen van de NIH (R01AR066562) en van de Orthopedic Research and Education Foundation-Smith and Nephew award. Het team wil de HFIR-ondersteuningsteams bedanken die het gebruik van de neutronenverstrooiingsbundellijnen mogelijk maken.
Aluminum containers | custom | Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | Mouse lung sample containment |
Deionized water or deuterium oxide | Water or D2O can be used to enhance contrast, plant sample | ||
Ethanol | Fisher | 04-355-223 | Mouse lung sample |
Gauze sponges | CardinalHealth | Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample | |
Growth chamber | Conviron | A1000 | Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample |
Laboratory balance | Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample | ||
Pure silica sand | US Silica Co. | Flint#13 | Pure SiO2 provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample |
Sprague-Dawley Rats | Harlan | Order Code: 002-US | Rat femur sample |
Titanium Rod | Goodfellow | TI007905 | Rat femur sample |