Bu protokol, beyin dilimlerinde tek nöral kök hücre ve nöroniçine mikroenjeksiyon için robotik bir platform kullanımını göstermektedir. Bu teknik çok yönlüdür ve yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip dokudaki hücreleri izleme yöntemi sunar.
Gelişimsel nörobiyolojide temel bir soru, nöral kök ve ata hücrelerinin beyni nasıl oluşturduğudur. Bu soruyu cevaplamak için, bir etiketlemek gerekir, işlemek, ve zaman içinde yüksek çözünürlük ile beyin dokusunda tek hücreleri takip. Bu görev son derece beyindeki dokuların karmaşıklığı nedeniyle zordur. Yakın zamanda bir robot geliştirdik, bir mikroskoptan elde edilen görüntüleri kullanarak tek hücrelere femtolitre hacimleri çözüm sağlayan beyin dokusuna mikroenjeksiyon iğnesi gönderen. Robotik operasyon, manuel mikroenjeksiyondan daha büyük bir büyüklük sırası olan ve canlı dokudaki tek hücrelerin hassas etiketlemeve esnek manipülasyonuna olanak tanıyan genel bir verim elde ederek artar. Bununla, tek bir organotipik dilim içinde yüzlerce hücremikroenjekte edebilirsiniz. Bu makale, beyin dokusu dilimlerinde nöral progenitor hücreleri ve nöronların otomatik mikroenjeksiyon için mikroenjeksiyon robot kullanımını göstermektedir. Daha geniş anlamda, pipetle ulaşılabilen bir yüzeye sahip herhangi bir epitel dokusunda kullanılabilir. Kurulduktan sonra, mikroenjeksiyon robotu dakikada 15 veya daha fazla mikroenjeksiyon gerçekleştirebilir. Mikroenjeksiyon robotu, veri metodu ve doğruluğu nedeniyle mikroenjeksiyonu biyomühendislik, biyoteknoloji ve biyofizikte organotipik beyin dilimlerinde tek hücreli analizler yapmak için kullanılacak çok açık, yüksek performanslı bir hücre manipülasyon tekniği haline getirecektir.
Bu protokol, özellikle tek nöral kök hücrelere ve nörona odaklanarak, beyin doku dilimlerindeki tek hücreleri hedeflemek ve işlemek için bir robotun kullanımını açıklar. Robot gelişimsel nörobiyoloji merkezi bir soruyu ele almak için geliştirilmiştir, bu nasıl sinirsel kök ve döl hücreleri beyin morfogenez1 katkıdabulunmak ,2,3,4,5. Bu soruyu cevaplamak için tek nöral kök hücreyi etiketlemek ve takip etmek ve doku morfogenezi ile tek hücre davranışını ilişkilendirmek için zaman içinde soy ilerlemesini takip etmek gerekir. Bu farklı şekillerde elde edilebilir, örneğin, rahim içinde beyin dokusu elektroporating veya lipophilic kalıpları kullanarak tek hücre etiketleme ile. Güçlü olmasına rağmen, bu yöntemler kesin tek hücre çözünürlüğü (elektroporasyon) ve / veya hücre içi alanı (lipophilic boya) işlemek için olasılığı yoksundur. Tek hücrelere mikroenjeksiyon bu zorluğu aşmak için geliştirilmiştir6,7,8. Mikroenjeksiyon sırasında, bir pipet kısaca reaktiflerin femtolitre hacimleri mikroenjekte basınç altında bozulmamış doku içinde tek bir hücreiçine yerleştirilir9. Daha önce organotipik dokuda tek nöral kök hücre mikroenjekte için manuel bir prosedür tarif ettik (Şekil 1A)10,11. Nöral kök hücrelere mikroenjeksiyon, floresan boya içeren bir çözelti enjekte etmek için tek sinirsel kök hücrelere yerleştirilen bir mikropipetin kullanımına dayanır. Nöral kök hücrelerin seçici hedefleme ventriküler yüzey (veya ventrikül, Şekil 1Akarikatür bakınız) üzerinden gelişmekte olan telensefalon yaklaşarak elde edilir , apikal atajenlerin apikal plazma membran ı tarafından oluşturulan (Şekil 1Akarikatür). Bu işlem, deneycinin enjekte etmek istediği her hücre için tekrarlanmalıdır. Ayrıca, mikroenjeksiyon başarısı dokuda mikropipet enjeksiyon derinliği ve süresi kesin kontrolü bağlıdır. Böylece, benzersiz avantajlarına rağmen, manuel mikroenjeksiyon son derece sıkıcı ve makul verim ve verim gerçekleştirmek için önemli bir uygulama gerektirir, bu teknik zor ölçeklenebilir bir şekilde kullanmak için yapım. Bu sınırlamayı aşmak için, yakın zamanda otomatik olarak tek hücrelere mikroenjeksiyon lar gerçekleştirebilen bir görüntü güdümlü robot, Autoinjector12 (veya mikroenjeksiyon robotu) geliştirdik.
Mikroenjeksiyon robotu mikroenjeksiyon için doku içinde 3-B alanda belirli yerleri tam olarak hedeflemek için mikroskobik görüntüleme ve bilgisayar görme algoritmaları kullanır(Şekil 1B). Mikroenjeksiyon robotu mevcut bir mikroenjeksiyon kurulumu nda nispeten basit değişiklikler yaparak inşa edilebilir. Mikroenjeksiyon robotunun genel şeması Şekil 1C’degösterilmiştir. Bir pipet üç eksenli manipülatör bağlı bir pipet tutucu monte edilir. Bir mikroskop kamera doku ve mikroenjeksiyon iğne görüntüleri elde etmek için kullanılır. Pipetin içindeki basıncı kontrol etmek için özel bir basınç düzenleme sistemi kullanılır ve mikroenjektör pipetin konumunu kontrol etmek için programlanabilir bir mikromanipülatör kullanılır. Mikroenjeksiyon pipet ucunun mekansal konumunu ve mikroenjeksiyonların yapılması gereken yerleri belirlemek için doku ve mikroenjeksiyon pipetinin kamera görüntüleri kullanılır. Yazılım daha sonra doku içinde pipet taşımak için gerekli yörüngeleri hesaplar. Tüm donanım, daha önce geliştirdiğimiz yazılım tarafından kontrol edilir. Tüm yazılımlar kodlama dilinde yazılmıştır (örneğin, Python ve Arduino) ve https://github.com/bsbrl/Autoinjector’dan talimatlarla indirilebilir. Grafik kullanıcı arayüzü (GUI) kullanıcı doku ve mikropipet görüntü ve mikroenjeksiyon yörüngesini özelleştirmek için izin verir. Sistemimiz brightfield ve epi-floresan filtreleri ile donatılmış bir ters mikroskop nispeten basit değişiklikler kullanılarak kurulabilir.
İlk olarak, mikroenjeksiyon için beyin organotipik doku dilimleri hazırlanması hakkında talimatlar sağlar. Daha sonra protokol, mikroenjeksiyon dan önce yapılması gereken pipet hareket kalibrasyonu gibi hazırlık adımlarını takip eden mikroenjeksiyon robotuna başlamayı göstermektedir. Bunu enjeksiyon parametreleri tanımlayarak takip eder. Bundan sonra, kullanıcı mikroenjeksiyon robotu tarafından kullanılan yörüngeyi tanımlayabilir ve enjeksiyon işlemini başlatabilir. Mikroenjekte doku (bu durumda beyin organotipik doku dilimleri) deneysel tasarım10,11bağlı olarak farklı zaman dilimleri için kültür tutulabilir. Doku takip etmek ve enjekte hücrelerin kimliği ve kaderi ve bunların dölleri çalışma işlenebilir. Alternatif olarak, mikroenjekte edilen hücreler canlı görüntüleme kullanılarak takip edilebilir. Bu protokol kapsamında robotun, e14.5 dorsal telensefalon faresinin organotipik dilimlerinde otomatik olarak mikroenjeksiyon nöral progenitor hücrelerine kullanımını gösteriyoruz. Robot daha fazla fare telencephalon yenidoğan nöronlar içine mikroenjeksiyon yeteneğine sahiptir, yanı sıra insan fetal telencephalon12.
Özetle, dokudaki tek hücreleri takip etmek ve işlemek için kullanılabilecek robotik bir platformu tanımlıyoruz. Platform basınç kullanır ve bu nedenle, enjekte etmek için bileşiğin kimyasal doğası olarak son derece çok yönlüdür. Buna ek olarak, kök hücreler dışındaki hedef hücrelere adapte edilebilir. Sistemimizin diğer model sistemlerine de kolayca adapte olmasını bekliyoruz.
Dokuda tek nöral kök hücrelere mikroenjeksiyon mükemmel tek hücre çözünürlüğü sağlar ve bu nedenle nöral kök hücre ilerlemesi ve kader geçişi hücre biyolojisi incelemek için kullanılmıştır(Şekil 2; ayrıca bakınız10,11,12). Otomatik mikroenjeksiyon işlemi hem embriyonik farelerde hem de insan beyin dokusundaki diğer hücre türlerine yapılabilir. Telensefalon bazal yüzeyini hedef alarak yenidoğan nöronların mikroenjeksiyonunun temsili sonuçları Şekil 3’tegösterilmiştir.
Burada kurulan ilke embriyonik fare beyinleri ve insan beyinlerinde birkaç farklı hücre tipini hedeflemek için uygulanabilir. Daha önce mikroenjeksiyon robotu da fare arka beyin ve telencephalon ve fare ve insan gelişmekte olan neokorteks 12 yenidoğan nöronlarda tek progenitor hücreleri hedef için kullanılabilir göstermiştir12. Enjeksiyon prosedürüen iyi sonuçları elde etmek için, bir enjeksiyon başlamadan önce tüm adımları optimize etmelidir. Beyin dokusundan canlı ve iyi korunmuş organotipik doku dilimlerinin hazırlanmasını dikkatle değerlendirmek ve optimize etmek önemlidir(Şekil 1). Şekil 1’degösterilen diseksiyon ve dilimleme işleminde hızlı olmak çok önemlidir. APEtik enjeksiyon apetik yüzey hedefleyen için, bir apikal yüzeyin ideal yönünü gösteren dilimleri almak gerekir. AP enjeksiyonu için ideal oryantasyon Petri kabının dibine dik apikal yüzeydir. Başka bir oryantasyon da izin verici olacaktır, ancak Petri kabına dik apikal yüzey enjeksiyon için daha geniş bir yüzey alanı sağlar, böylece enjeksiyon başarısını artırır. Nöronlar içine enjeksiyon için, dilimin yönünü hiçbir etkisi çok az oynar.
Enjekte edilecek dilimler seçildikten sonra, dilim başına enjeksiyon işlemi yaklaşık 5 dakika sürer. Kişinin canlı doku ile çalıştığı düşünülürse, enjeksiyon işleminin hızlandırilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu amaçla, gereksiz bekleme süresini azaltmak için doku hazır olmadan önce GUI(Şekil 1D)üzerinden enjeksiyon için tüm parametrelerin ayarlanması tavsiye edilir. Sorun giderme için lütfen Ek dosyaya bakın.
Uzun süreli dilim kültürü söz konusu olduğunda, otomatik mikroenjeksiyon işleminden sonraki adımlar hücrelerin sağlığını ve deneyi etkileyebilir. Bu nedenle, bir kalite kontrol testi çalıştırmak ve dilim kültür koşullarını optimize etmek için şiddetle tavsiye edilir. Dilimleme ve enjeksiyon işleminden sonra hücre canlılığını değerlendirmek için kültür sırasında EdU etiketleme uyguladık ve kültürlerde ve enjekte edilendoku12’dekipyknotic çekirdeklerin (apoptotik hücreler için bir proxy) sayısını ölçtük. Bu nicelemeler mikroenjeksiyonun doku canlılığı üzerinde önemli bir etkisi olmadığını ortaya çıkarmıyordu(Şekil 2C). Laboratuvarda organotipik doku dilimleme ve mikroenjeksiyon boru hattı kurarken benzer kalite kontrolleri yapmanızı öneririz.
Manuel mikroenjeksiyon ile karşılaştırıldığında, mikroenjeksiyon robotu çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, kullanıcı için öğrenme eğrisi manuel enjeksiyona kıyasla daha az diktir: yeni bir kullanıcı, genellikle 1 veya 2 olmak üzere sınırlı sayıda seanstan sonra yüksek bir yeterliliğe ulaşacaktır. İkinci olarak, manuel mikroenjeksiyon durumunda, karşılaştırılabilir bir yeterlilik eğitim ay gerektirir. Enjeksiyon işlemi daha hızlı ve daha verimlidir(Şekil 2B). Bu parametreleri ölçtük ve mikroenjeksiyon robotunun enjeksiyon başarısı (başarılı enjeksiyon/toplam enjeksiyon sayısı) ve birim zaman başına enjeksiyon sayısı12ile ilgili olarak yetenekli bir manuel kullanımdan daha iyi performans gösterdiğini gördük. Bu, mikroenjeksiyon robotu için yetenekli bir kullanıcıya kıyasla enjeksiyon veriminin %300 oranında artmasıyla sonuçlanır. Mikroenjeksiyon robotu yeni başlayan bir kullanıcıyla karşılaştırıldığında verimlilikteki artış daha da belirgindi ve %700’e ulaştı. Son olarak, mikroenjeksiyon robotu tüm mekansal parametreleri sistematik olarak keşfetmek için kolayca programlanabilir. Bu, mikroenjeksiyon robotu yeni hücreleri veya dokuları hedeflemeye adapte ederken veya mikroenjeksiyon robotu farklı uzamsal çözünürlük gerektiren amaçlar için kullanırken özellikle avantajlıdır.
Mikroenjeksiyon robotu oluşturmak için mevcut epi-floresan mikroskobunda minimum değişiklikler gerektirir12. Daha önce https://github.com/bsbrl/Autoinjector bu adaptasyon için talimatlar verdik. Donanım kurulduktan sonra, bu protokol otomatik mikroenjeksiyonları başarıyla üstlenmek için önemli metodolojik ayrıntılar sağlar. Genel olarak, mikroenjeksiyon robotu 15,52 + 2,48 enjeksiyon/dk, deneyimsiz bir kullanıcı (1,09 ± 0,67 enjeksiyon/dk) daha büyük ve 3kat uzman bir kullanıcı (4,95 ± 1,05 enjeksiyon/dk)12daha büyük başarılı bir enjeksiyon oranına sahiptir. Başarılı enjeksiyon hızındaki bu gelişme, hem acemi hem de uzman kullanıcıların doku canlılığını korumak için gerekli olan daha kısa sürede daha fazla hücre enjekte etmesini sağlar. Ayrıca, mikroenjeksiyon robotözelleştirilebilir ve yörünge, enjeksiyon derinliği, enjeksiyon sayısı, enjeksiyonlar arasında boşluk tüm GUI kullanılarak ayarlanabilir. Bu özellikler, mikroenjeksiyon robotun daha önce zahmetli deneyleri optimize etmek ve daha önce mümkün olandan daha yüksek verim gerektiren temelde yeni deneyleri keşfetmek için bir araç olarak kullanılmasını sağlar.
Burada açıklanan mikroenjeksiyon prosedürünün temel sınırlamaları, geniş optimizasyon gerektiren önemli bir adım olan doku dilimlerinin hazırlanmasıile ilgilidir. Buna ek olarak, mikroenjeksiyon cam pipet ile yaklaşılabilir bir yüzeyin varlığı dayanır. Bu özellik, mevcut kurulum kullanılarak mikroenjeksiyon ile hedeflenebilen doku ve doku konumlarının türünü sınırlar.
Mikroenjeksiyon robotu şu anda brightfield görüntüleme kullanır ve in vitro beyin dilimi preparatları kullanılmıştır. Gelecekte, mikroenjeksiyon robotu moleküler veya boya etiketleme için in vivo tek hücre hedefleme özgüllüğünü artırmak için 2-foton görüntüleme ile kombine edilebilir. Bu tür çabalar zaten tek hücreli elektrofizyoloji15,16için yapılmıştır. Mevcut cihaz mikroenjeksiyon prosedürümanuel gözlem gerektirir. Gelecekteki sürümler tıkanmış mikroenjeksiyon pipetleri temizleme stratejileri içerebilir17 veya çok katlı, tamamen otonom mikroenjeksiyonlar için sıvı işleme robotlar18 entegrasyonu. Bu cihazlar büyüklük siparişleri ile mikroenjeksiyon ölçeğini artırabilir. Birden fazla mikroenjeksiyon pipet19 paralel kontrol için algoritmalar adapte aynı deneyler içinde aynı hücrelere boyalar ve moleküler reaktifler düzinelerce çok katlı teslim sağlayabilir. Bu dokumoleküler tarama için yeni yollar açmak için potansiyele sahiptir.
Mikroenjeksiyon robotu DNA veya RNA barkodları kullanarak işlevsel olarak tanımlanmış hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Bu da tek hücreli RNA sekanslama (scRNAseq) ve elektron mikroskobu gibi diğer tek hücre analizi teknikleri ile kombine edilebilir. İlk sonuçlarımız, mikroenjekte edilen hücrelerin ve bunların soyundan gelen hücrelerin, facs ayrışması (Taverna, yayınlanmamış sonuçlar) ile takip eden doku ayrışması kullanılarak kurtarılabilen ve izole edilebilen bir hücre olduğunu göstermektedir. FACS sıralanmış hücreler daha sonra scRNAseq için kullanılabilir. Ayrıca, ilk sonuçlar mikroenjeksiyon robotunun tek hücre çözünürlüğü yeteneklerinin elektron mikroskobik analizi ile birlikte yüksek uzamsal çözünürlükte (Taverna ve Wilsch-Bräuninger, yayınlanmamış sonuçlar) dokudaki nöral kök hücreler üzerindeki hücre biyolojisini keşfetmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu veriler, mikroenjeksiyon robotunun dokuda ve daha geniş anlamda dokuda ışık ve elektron mikroskobu için bir araç olarak kullanılabileceğini, hücre kimliğinin ve dokudaki davranışın multimodal analizi için kullanılabileceğini göstermektedir.
Mikroenjeksiyon basınç kullanımına dayanır ve yüksek moleküler karmaşıklık (örneğin, tüm bir transkripsiyon) ile enjekte çözümleri gelemez. Mikroenjeksiyonun bu özelliği geçmişte ligand kapılı reseptörleri izole etmek ve klonlamak için kullanılmıştır20. Bu doğrultuda, mikroenjeksiyon robotu modelleme ve hücresel düzeyde çok jenik özellikleri çalışma için kullanılabilir. Bir alt havuzlama stratejisi ile birlikte, mikroenjeksiyon robotu da belirli bir özellik / hücresel davranış sürüş genlerin minimum kümesini tanımlamak için bir platform olarak kullanılabilir. Şimdiye kadar, mikroenjeksiyon robotmRNA, DNA veya rekombinantproteinler10,21,22teslim yoluyla hücrenin biyokimya işlemek için kullanılmıştır. Mikroenjeksiyon robotunun hücre içi uzayın biyofiziğinin araştırılmasında, örneğin, hücre içi uzayın biyofiziksel özelliklerini algılamaya ve/veya manipüle etmesine olanak tanıyan nanomalzemeler veya nanomakineler sunarak uygulanmasını öngörüyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Nomis Vakfı (ET) kabul etmek istiyorum. SBK, Makine Mühendisliği bölümünden fon kabul Bilim ve Mühendislik Koleji, Minnesota Üniversitesi, Minnesota yüksek öğretim bölümü MnDRIVE RSAM girişimi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) 1R21NS103098-01, 1R01NS1111028, 1R34NS1111654, 1R21NS112886 ve 1R21 NS1111966. GS, National Science Foundation Graduate Research Fellowship ve NSF IGERT eğitim bursu ile desteklenmiştir.
Chemicals | |||
Agarose, Low Melt | Carl Roth | Cat# 6351.2 | |
Agarose, Wild Range | Sigma-Aldrich | Cat# A2790 | |
Best-CA 221 Glue | Best Klebstoffe GmbH & Co.KG | Cat# CA221-10ml | |
B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17504044 | |
Cellmatrix Type-IA (Collagen, Type !) | FUJIFILM Wako Chemicals | Cat# 637-00653 | |
Distilled Water | |||
DMEM-F12, CO2 independent (w/o Phenol red) | Sigma-Aldrich | Cat# D2906 | |
DMEM-F12, CO2 independent (with Phenol red) | Sigma-Aldrich | Cat# D8900 | |
HEPES-NAOH, pH 7.2, 1M (HEPES buffer) | Carl Roth | Cat# 9105.3 | |
L-Glutamine, 200 mM | Thermo Fisher Sientific | Cat# 25030024 | |
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | Cat# 81381 | |
N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | Cat# 17502048 | |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 21103049 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | Cat# AM9937 | |
O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) Mix, 50 liters | |||
Paraformaldehyde | Merck | Cat# 818715 | |
PBS | |||
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15140122 | |
Rat serum | Charles River Laboratories | ||
Japan | |||
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | Cat# 106323 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | Cat# 106482 | |
Tyrode’s salt | Sigma | Cat# T2145-10x1L) | |
Equipment | |||
Borosilicate glass capillaries, 1.2 mm outer diameter x 0.94 mm inner diameter | Sutter Instruments | Cat# BF-120-94-10 | |
Bottle-top filter system, 500 mL | Corning | Cat# 430769 | |
Computer PC | |||
Custom pressure rig | Custom pressure rig | ||
Electronic pressure regulator | Parker Hannifin | Cat# 990-005101-002 | |
Falcon tubes, 15 mL | Corning | Cat# 430791 | |
Falcon tubes, 50 mL | Corning | Cat# 430829 | |
Fine-tip paintbrush | |||
Flaming/ Brown micropipette puller | Sutter Instruments | Cat# P-97 | |
Forceps, Dumont no. 3 | Fine Science Tools | Cat# 11231-30 | |
Forceps, Dumont no. 5 | Fine Science Tools | Cat# 11255-20 | |
Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | Cat# 11252-20 | |
Heating block | Labtech International | Cat # Dri block Digi2 | |
Inverted fluorescence microscope | Zeiss | Cat# Axiovert 200 | |
Light source | Olympus | Cat# Highlight 3100 | |
Manual pressure regulator | McMaster Carr | Cat# 0-60 PSI 41795K3 | |
Microloader Tips | Eppendorf | Cat# 5242956.003 | |
Microcontroller | Arduino | Cat# Arduino Due | |
Microscope camera Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3 | |||
Motorized stage XY for microscope | |||
Multiwell plate, 24 wells | Nunc | Cat# 142475 | |
Pasteur pipettes, plastic | |||
Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner | Cat# 628102 | |
Petri dish, 35 x 10 mm | Nunc | Cat# 153066 | |
Petri dish, 34 x 14 mm, including Microwell no. 1.5 cover glass | MatTek | Cat# P35G-1.5-14-C | |
Pipette holder | Warner Instruments | Cat# 64-2354 MP-s12u | |
Pipette and tips | |||
Puller filament, 3.0-mm square box filament | Sutter Instrument | Cat# FB330B | |
Slice culture incubation box | MPI-CBG | Cat# custom made | |
Solenoid valve | Cat# LHDA053321H-A | ||
Stereomicroscope | Olympus | Cat# SZX12 | |
Tabletop centrifuge | Heraeus | Cat# 5431622 | |
Thermometer | |||
Three-axis Manipulator | Sensapex Inc | Cat# tree-axis uMP | |
Vibratome | Leica | Cat# VT1000s | |
Whole-embryo-culture-system incubator | Ikemoto Company | Cat# RKI-10-0310 | |
Waterbath | |||
Software and Algorithms | |||
Arduino | Arduino | ||
Fiji | RRID: SCR_002285 | ||
Python | Python Software foundation | Python 2.7.12 | |
ZEN | RRID: SCR_013672 |