Dit werk beschrijft twee methoden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, een verbeterde xenotransplantatie-opstelling op chorioallantoïsch membraan (CAM) van vogelembryo’s die vascularisatie van gekweekte embryonale organen en organoïden mogelijk maakt en een nieuwe vaste z-richting orgaankweekmethode met gewijzigde experimentele omstandigheden die hoge resolutie time-lapse confocale beeldvorming mogelijk maakt.
Embryonale nier organotypic culturen, en vooral pluripotente stamcel-afgeleide nier organoïden, zijn uitstekende instrumenten voor het volgen van ontwikkelingsprocessen en modellering nierziekte. De modellen worden echter beperkt door een gebrek aan vascularisatie en functionaliteit. Om dit aan te pakken, werd een verbeterd protocol ontwikkeld voor de methode van xenografting cellen en weefsels aan het chorioallantoïsche membraan (CAM) van een vogelembryo om vascularisatie en herstel van de bloedstroom te krijgen. De grafts zijn bedekt met op maat gemaakte minireservoirs die de monsters vast te stellen aan de CAM en hen te voorzien van cultuur medium dat de grafts beschermt tegen het drogen. De verbeterde cultuurmethode maakt het mogelijk xenografts tot 9 dagen te laten groeien. Het manuscript beschrijft ook hoe optimale omstandigheden te bieden voor langdurige confocale beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen met behulp van de eerder gepubliceerde Fixed Z-Direction (FiZD) methode. Deze methode comprimeert voorzichtig een embryonaal orgaan of organoïde tussen een glazen afdekking en membraan in een grote hoeveelheid medium en biedt uitstekende omstandigheden voor beeldvorming voor maximaal 12 dagen. Samen maken deze methoden vascularisatie en bloedtoevoer naar nierorganoïden en organotypic nierculturen mogelijk met verbeterde confocale beeldvorming. De hier beschreven methoden zijn zeer gunstig voor het bestuderen van fundamentele en toegepaste functies van nieren ex vivo. Beide methoden zijn van toepassing op verschillende soorten weefsels en organoïden.
Organotypic cultuur van embryonale nieren werd een belangrijk model om nefrogenese decennia geleden te bestuderen1,2,3. Nierorganoïden vertegenwoordigen een geavanceerd modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling van gezonde en zieke nieren4. Het belangrijkste nadeel voor beide methoden is echter dat geen van beide methoden de belangrijkste functie van de nier recapituleert: bloedfiltratie. Nefrons en niervabulatuur ontwikkelen zich in nierorganoïden en organotypic culturen op dezelfde manier als vroege stadium in vivo ontwikkeling; echter, de glomeruli gevormd in vitro blijven avasculaire5. Vascularisatie van ex vivo embryonale nieren en nierorganoïden werd eerder in transplantatie-experimenten alleen onder in vivo omstandigheden aangetoond. Bijvoorbeeld, transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide nier-organoïden onder een muis niercapsule maakt de ontwikkeling van de nefron in de organoïde naar een functionele fase6.
Een tussenbenadering tussen zuiver in vitro culturen en in vivo transplantatiemethoden is xenotransplantatie naar de CAM van vogelembryo’s. Vascularisatie van intacte muis nier primordia is eerder aangetoond met behulp van dit systeem7,8. Er werd echter ook aangetoond dat de niervasculatuur in de xenotransplanted murinenier was afgeleid van het gastheerendotheel, niet het transplantaat9. Deze observatie verminderde het potentieel van chimaerige (aviaire zoogdieren) modellen van embryonale nieren aanzienlijk om de ontwikkeling van de niervasculatuur te bestuderen, omdat de experimentele omstandigheden niet tolerant waren voor het overleven van donor-afgeleide endotheelcellen.
Gepresenteerd in het eerste deel van dit protocol is een verbeterde methode voor de teelt van muis embryonale nieren op CAM van vogeleieren, een combinatie van micromilieuomstandigheden van organotypic cultuur en xenotransplantatie. De belangrijkste verbetering ten opzichte van eerdere methoden is dat in plaats van het plaatsen van de muis embryonale nieren en nierorganoïden direct op de CAM, de implantatie gebied is bedekt met doorlatende minireservoirs gevuld met cultuur medium dat de getransplanteerde weefsel te leveren met voedingsstoffen en te beschermen tegen het drogen. Het slagingspercentage van de experimenten neemt aanzienlijk toe en de voorwaarden voor de ontwikkeling van vasculatuur van donoren verbeteren. Toepassing van deze methode op xenotransplant culturen resulteert in de ontwikkeling van glomeraire vasculatuur bestaat uit endogene endotheelcellen uit donornieren.
Gedetailleerde analyse van cellulaire morfogenese is een andere belangrijke toepassing van niercultuur modellen. Eerder gerapporteerde methoden voor time-lapse beeldverwerving van nierculturen zijn alleen voldoende voor analyse van de algehele morfologie en patronen van embryonale nieren, maar niet voor het bijhouden van individuele cellen10. Onlangs werd een nieuwe Fixed Z-Direction (FiZD) methode gericht op hoge resolutie confocale 3D time-lapse beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen beschreven11. Bij deze methode worden de organoïden en embryonale organen voorzichtig samengeperst tussen een glazen afdekkingsslip en een doorlaatbaar membraan van een transwellinsert in een op maat ontworpen plaat totdat de dikte van het monster 70 μm bereikt, wat optimale optische omstandigheden voor beeldvorming biedt. In het tweede deel van de methoden wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de fabricage van een op maat gemaakte plaat en de opstelling van FiZD-experimenten voor organoïde beeldvorming op lange termijn.
Er worden twee gedetailleerde protocollen gepresenteerd die de klassieke nierorganotypic-kweekmethode verfijnen en vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en optimale 4D-beeldvorming (d.w.z. 3D-beeld en tijd) van ex vivo embryonale nieren en organoïden mogelijk maken. In deze sectie worden de kritieke stappen in de methoden belicht en worden probleemoplossingbesproken.
Het belangrijke verschil tussen andere CAM-kweekmethoden en deze verbeterde kipCAM-kweekmethode is het gebruik van op maat g…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd financieel ondersteund door de Suomen Akatemia (Academie van Finland) (206038, 121647, 250900, 260056; Centre of Excellence grant 2012-2017 251314), Munuaissäätiö – Finse Kidney and Liver Association, de Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, The Swedish Cultural Foundation in Finland, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Cancer Society of Finland), het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (KP7/2007-2013; grant FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) en H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network “RENTRACTALALAL” Project ID 642937. De auteurs danken Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias en Hannele Härkman voor technische bijstand.
Figuren 3, 4 en Film 2 worden herdrukt met toestemming van Development.
Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
Ethanol (70%) | VWR | ||
Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
Matrigel | Corning | 356230 | |
On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |