Une méthode de co-culture pour étudier la croissance de la neurite en réponse aux signaux dentaires de paracrine de pulpe
概要
Nous décrivons l’isolement, la dispersion et le placage des cellules primaires de pulpe dentaire (DP) avec les neurones trigéminaux (TG) cultivés au-dessus des filtres transwell. Les réponses cellulaires des cellules DP peuvent être analysées avec l’immunofluorescence ou l’analyse d’ARN/protéine. L’immunofluorescence des marqueurs neuronaux avec la microscopie confocale permet l’analyse des réponses de excroissance neurite.
Abstract
L’innervation des dents permet aux dents de sentir la pression, la température et l’inflammation, qui sont toutes cruciales pour l’utilisation et l’entretien de l’organe dentaire. Sans innervation sensorielle, les activités orales quotidiennes causeraient des dommages irréparables. Malgré son importance, les rôles de l’innervation dans le développement et l’entretien des dents ont été largement négligés. Plusieurs études ont démontré que les cellules DP sécrètent des protéines de matrice extracellulaire et des signaux paracrines pour attirer et guider les axones TG dans et tout au long de la dent. Cependant, peu d’études ont fourni un aperçu détaillé dans le crosstalk entre le mesenchyme DeP et les afferents neuronaux. Pour combler cette lacune dans les connaissances, les chercheurs ont commencé à utiliser des co-cultures et une variété de techniques pour étudier ces interactions. Ici, nous démontrons les étapes multiples impliquées dans la co-culture des cellules primaires de DP avec des neurones de TG dispersés sur un filtre de transwell sus-lying avec des pores de grand diamètre pour permettre la croissance axonale par les pores. Des cellules primaires de DP avec le gène d’intérêt flanqué des emplacements de loxP ont été employées pour faciliter la suppression de gène utilisant un système de recombinase d’Adenovirus-Cre-GFP. L’utilisation des neurones TG de la souris Thy1-YFP a permis une imagerie afferente précise, avec une expression bien au-dessus des niveaux de fond par microscopie confocale. Les réponses dP peuvent être étudiées par la collecte et l’analyse de protéine ou d’ARN, ou alternativement, par la coloration immunofluorescente des cellules de DP plaquées sur des couvertures en verre amovibles. Les médias peuvent être analysés à l’aide de techniques telles que les analyses protéomiques, bien que cela nécessitera l’épuisement de l’albumine en raison de la présence de sérum bovin fœtal dans les médias. Ce protocole fournit une méthode simple qui peut être manipulée pour étudier les réponses morphologiques, génétiques et cytosquelettiques des neurones TG et des cellules DP en réponse à l’environnement contrôlé d’un test de co-culture.
Introduction
L’innervation des dents permet aux dents de sentir la pression, la température et l’inflammation, qui sont toutes cruciales pour l’utilisation et l’entretien de l’organe dentaire. Le fait de ne pas sentir la douleur dentaire associée aux caries dentaires et aux traumatismes entraîne une progression de la maladie. Ainsi, l’innervation appropriée est une exigence pour la croissance normale de dent, la fonction et les soins.
Alors que la plupart des organes sont entièrement fonctionnels et innervés au moment de la naissance, le développement des dents s’étend à la vie adulte, avec l’innervation des dents et la minéralisation se produisant de concert pendant les étapes postnatales1,2. Fait intéressant, la pulpe dentaire (DP) mesenchyme sécrète d’abord des signaux répulsifs au cours de l’embryogenèse pour empêcher l’entrée d’axone dans l’organe dentaire en développement, qui se déplace plus tard à la sécrétion de facteurs attractants que la dent se rapproche éruption3,4. Pendant les stades postnatals, les axones afférents du nerf trigéminal (TG) pénètrent dans et tout au long de la dent autour du dépôt de dentin de temps commence (examiné dans Pagella, P. et autres5). Plusieurs études in vivo ont démontré que les interactions neuronales-mesenchymal guident l’innervationdes dents chez la souris (revue dans Luukko, K. et al.6 ), mais peu de détails des mécanismes moléculaires sont disponibles.
Les cocultures cellulaires fournissent des environnements contrôlés dans lesquels les chercheurs peuvent manipuler les interactions entre les populations neuronales et mésenchymales. Les expériences de co-culture permettent d’approfondir les voies de signalisation guidant l’intérivation et le développement des dents. Cependant, plusieurs des méthodes conventionnelles utilisées pour étudier les cellules en co-culture présentent des défis techniques. Par exemple, la coloration violette de cristal de la croissance de neurite peut non-spécifiquement tacher des cellules de Schwann incluses dans des dispersions de faisceau de TG, et il peut y avoir des crêtes dans l’intensité de couleur avec des réponses relativement petites7. Les chambres microfluidiques offrent une option attrayante, mais sont considérablement plus chères que les filtres transwell8,9 et ne permettent que l’étude des réponses neuronales aux sécrétions DP. Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé un protocole qui permet : a) la coloration précise et l’imagerie de la croissance de neurite de TG en réponse aux sécrétions de DP, b) la modification génétique des cellules dP et/ou des neurones de TG pour étudier des voies de signalisation spécifiques, et c) l’étude des réponses de cellules de DP aux facteurs sécrétés par des neurones de TG. Ce protocole fournit la capacité d’étudier précisément plusieurs caractéristiques de l’innervation des dents dans l’environnement contrôlé d’un résultat de co-culture in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les activités quotidiennes de la cavité buccale exigent que les dents sentent des stimuli externes et une inflammation interne afin de permettre une utilisation et un entretien appropriés. Cependant, seulement peu d’information est disponible concernant les signaux qui conduisent les processus développementaux de l’innervation de dent. Ce protocole fournit une méthode pour isoler et co-culture des cellules primaires DP et des neurones TG afin d’étudier la communication croisée entre les deux populations. Plu…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par a) la subvention des National Institutes of Health/NIAMS (numéros de subvention R01 AR062507 et R01 AR053860 à RS), b) la subvention de l’Université de l’Alabama à Birmingham Dental Academic Research Training (DART) (numéro T90DE022736 (PI MacDougall)) au SBP du National Institute of Dental and Craniofacial Research/National Institutes of Health, c) une subvention pilote et de faisabilité du UAB Global Center for Craniofacial, Oral and Dental Disorders (GC-CODED) à SBP et d) le National Institute of Dental and Craniofacial Subvention K99 DE024406 de Recherche/National Institutes of Health à SBP.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
参考文献
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. 神経科学. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. 神経科学. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
