Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Três grandes espécies de oxigênio reativo (ROS) produzidas pelo metabolismo celular que são de significado fisiológico são ânion de superóxido, radical hidroxis e peróxido de hidrogênio¹. Em baixas concentrações, participam de processos fisiológicos celulares, mas em altas concentrações têm efeitos adversos nas vias de sinalização celular¹. Nosso corpo desenvolveu sistemas antioxidantes, que são eficazes contra ros excessivos. No entanto, o estresse oxidativo pode ocorrer quando a ROS sobrecarrega a capacidade desintoxicante do nosso corpo, o que contribui para muitas condições patológicas, incluindo inflamação, câncer e doença neurodegenerativa^2,,3,4. O objetivo deste método é determinar o ros celular total em células aderentes usando a coloração de diacetato de 2′,7′-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). A lógica é que a oxidação de DCFH-DA a 2′-7’dichlororeoresceína (DCF) tem sido usada extensivamente para detecção total de ROS, incluindo radicais hidroxil (•OH) e dióxido de nitrogênio (•NO₂). Mecanicamente, DCFH-DA é tomado por células onde esterase celular cleaves fora dos grupos de acetil, resultando em DCFH. A oxidação de DCFH por ROS converte a molécula em DCF, que emite fluorescência verde em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm. Comparado com a detecção de fluorescência com citometria de fluxo e outros métodos alternativos⁵, as vantagens deste método usando um microscópio de fluorescência e um leitor de placas são que produz imagens fluorescentes claramente visíveis, e é fácil de executar, eficiente e econômico. Este método tem sido amplamente utilizado para detectar ROS celular para estudar várias condições^6,,7,8. Este protocolo é usado para detectar ros total em células aderentes. O uso deste método para detectar ROS em células de suspensão pode precisar de algumas modificações.