Представляем протокол для извлечения перицитов мурин. Основываясь на безантибиотиков обогащения ориентированных перицитов, этот протокол является ценным инструментом для исследования in vitro обеспечения высокой чистоты и высокой урожайности, тем самым уменьшая количество экспериментальных животных, используемых.
В последние годы церебральный перициты стали центром обширных исследований в области сосудистой биологии и патологии. Важность перицитов в формировании гематоэнцефалического барьера и физиологии в настоящее время продемонстрировано, но его молекулярная основа остается в значительной степени неизвестной. Поскольку патофизиологическая роль церебрального перицита при неврологических расстройствах интригует и имеет большое значение, модели in vitro не только достаточно уместны, но и способны включать различные методы для этих исследований. В качестве моделей in vitro были предложены несколько методов для извлечения перицитов головного мозга, хотя желательно использовать протокол, свободный от антибиотиков с высокой отдачей. Самое главное, метод, который увеличил выход на добычу снижает использование большего числа животных.
Здесь мы предлагаем простой и эффективный метод извлечения церебральных перицитов с достаточно высокой производительностью. Гомегенат ткани мозга мыши смешивается с раствором BSA-декестран для разделения тканевого мусора и микрососудистых гранул. Мы предлагаем трехэтапное разделение с последующей фильтрацией для получения микросудна богатый фильтррат. С помощью этого метода количество микрососудистых фрагментов, полученных от 10 мышей, достаточно для семени 9 скважин (9,6см каждая) из 6-колодца пластины. Самое интересное с этим протоколом, пользователь может получить 27 перицитов богатых скважин (9,6 см2 каждый) в проходе 2. Чистота перицитных культур подтверждается выражением классических перицитных маркеров: NG2, PDGFR-и CD146. Этот метод демонстрирует эффективный и осуществимый инструмент in vitro для физиологических и патофизиологических исследований перицитов.
Церебральный перициты являются важным компонентом нейрососудистой единицы (НВУ), которая включает в себя функциональную единицу с церебральными эндотелиальными клетками гематоэнцефалического барьера (BBB), глиальных клеток, внеклеточной матрицы и нейронов. Перициты являются жизненно важной частью регулируемого функционирования центральной нервной системы (ЦНС), поскольку они служат одним из интерфейсов для обмена молекулярной и клеточной информации.
Церебральный перициты встроены в аблюминальной стороне микрососудов мозга, и имеют важное значение для создания1 и поддержания2 физиологии BBB. Несколько последних работ также подчеркнули роль церебральных перицитов в ангиогенезе3 и созревания сосудов4, эндотелиальный морфогенез5 и выживание6, и в контроле метаболизма холестерина мозга7. Важно отметить, что дисрегуляция в любом из этих процессов являются этиологическими признаками нейродегенеративных заболеваний.
Действительно, перициты являются функциональной необходимостью для нормального функционирования BBB и его защиты от прогрессирования ряда неврологических заболеваний. Вырождающаяся физиология и потеря перицитов являются общими знаменателями в прогрессировании болезни Альцгеймера8,потери нейронов во время дисфункции белого вещества9,рассеянный склероз10, септический энцефалопатия11, острый фазовый ишемический инсульт12 и при других неврологических расстройствах. Перициты также играют важную роль в метастазах опухоли13. Интересно, что перициты также были показаны для демонстрации роли спасения после неврологических травм и расстройств: в ремиелинизации в головном мозге1, ишемический инсульт, повреждение спинного мозга14 и содействие ангиогенез15. Восприимчивость перицитов для усиления патофизиологического проявления неврологических травм и расстройств делает их потенциальной терапевтической целью16.
Модели исследований в пробирке перицитов в BBB являются важными инструментами для проведения обширных исследований. Эти модели обеспечивают платформу для более сложных исследований, представляя рабочие модели BBB и многое другое. Например, эти модели могут быть использованы для понимания клеточной физиологии в перицитах и среди других типов клеток НВУ. Кроме того, модели in vitro являются инструментами для исследования фармакологических исследований новых препаратов и молекул на перициты. Эти модели также могут быть использованы для понимания патофизиологической роли перицитов по отношению к неврологическим расстройствам. Тем не менее, разработка моделей in vitro требует увеличения объема производства, с тем чтобы обеспечить экспериментальную свободу. Эти модели должны быть простыми и быстрыми, и уменьшить количество экспериментальных животных, используемых. Кроме того, желательно разработать такие модели в модели двойной и тройной клеточной культуры.
Есть много протоколов, которые были разработаны. Протоколы, предложенные Tigges et al.17,Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20,и Крауч и Доэтч21 являются похвальными подходами, которые удовлетворяют большинство предметов первой необходимости. Все эти методы дают эффективные результаты, но зависимость от большого количества экспериментальных животных остается общим знаменателем для этих протоколов. Таким образом, становится обязательным разработать высокопроизводительный метод, который может изолировать и очищать перициты с максимально возможной эффективностью. В этом протоколе чистота клеток, полученная после второго прохода, проверяется несколькими перицитами. Мы проверили на тромбоцитов- Производные Фактор роста Рецептор-я (PDGFR- ) , который используется в качестве классического маркера перицитов17, и для NG2 (нейрон-глиальный антиген 2), который является маркером перицита опосредованного сосудистого морфогенеза22 и васкуляризации23. Мы также проверили кластер дифференциации 146 (CD 146), который был зарегистрирован как одна из молекул, выраженных в перицитах17,18.
Здесь мы представляем протокол для извлечения первичных перицитов у мышей (дикий тип или трансгенетика), который удовлетворит все вышеупомянутые требования с высокой производительностью. Мы используем антибиотик и иммунопаннинг бесплатный метод пролиферации первичных церебральных перицитов, который зарекомендовал бы себя как эффективная модель для проведения исследований в пробирке.
Церебрачные перициты являются неотъемлемой частью НВУ и играют активную роль в индукции и поддержании BBB24. Аналогичным образом, роль этих клеток в различных нейродегенеративных расстройств и сосудистых патологий интригует. Таким образом, эффективная высокоэффективная модель первичной перицитной ячейки обеспечит эффективную платформу для исследований in vitro.
Существуют различные протоколы, которые были предложены для изоляции первичных перицитов(рисунок 4). Tigges et al.17 предложили метод, включающий корковую ткань с оленями. Этот подход является тендеризация тканей из 6 мышей (37 кВ, 70 мин пищеварения с ферментами папаин / DNase следуют дезинтеграции шаг через 21 G и 18 G иглы. Этот протокол предполагает одношаговое разделение (центрифугирование в 22% растворе BSA/PBS), которое дает по крайней мере 2 коллагена, которые я покрывал колодцами 6-колодца. Клетки поддерживаются в эндотелиальной среде роста клеток (ECGM) до прохождения 3, а затем в среде роста перицитов (PGM) для пропускающих клеток для содействия пролиферации перицитов. В другом аналогичном подходе, Chen et al.18 предложил диссоциацию тканей, подав ткани стерилизованные лезвия бритвы и пищеварение ткани с коллагеназой/DNase в течение 90 мин при 37 градусах Цельсия. После одношагового разделения (центрифугирование в 22% BSA) клеток, слой миелина удаляется и гранулы промывают дважды в ECGM. Микрососуды покрываются в 3 колодцах коллагена, которые я покрывал 6-колодными пластинами. После достижения слияния, клетки проходят дважды, а затем поддерживается в PGM. В конце концов, если клетки передаются в соотношении 3, мы можем получить 27 скважин 6-ну колодца только при использовании 10 мышей в начале протокола.
В Томсен и др., авторы предлагают изоляции церебральных перицитов через двухступенчатый фермент пищеварения19. Удаляются менинги и белое вещество, а образцы мозга разрезаются на мелкие кусочки. Части ткани проходят первую реакцию фермента в коллагенезе/DNase I в течение 75 мин при 37 градусах По Цельсия, после одного шага разделения в 20% BSA. Гранулы собираются и далее перевариваются в коллагенезе/диспазе/DNase I в течение 50 мин при 37 градусах Цельсия. Этот шаг сопровождается разделением микросудов в градиенте Percoll 33% и далее промывается один раз. Микрососуды посеяны на коллагене IV/фибронектин покрытием 35 мм посуды. Распространение перицитов благоприятствует 10% FCS и гентамицин сульфат в DMEM в течение 10 дней. В другом двухступенчатом подходе к пищеварению ферментов, Yamazaki et al. предлагают измельчение вырезанной ткани в холодном DMEM20. В первой реакции фермента, образцы обрабатываются коллагеназа / DNase I в течение 75 мин при 37 градусов по Цельсию. После одного шага центрифугирования, гранулы снова промывают один раз и вторая реакция фермента инициируется в коллагеназе / диспазы в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия. После одношагового разделения гранулы вновь приостанавливаются и центрифугируется в 22% растворе BSA. Наконец, микрососудистые гранулы перекрываются и покрывают 6-колодецной пластиной. Для 5 мозга мыши, 1 хорошо 6-колой пластины могут быть покрыты. Для получения перицитов, эндотелиальные культуры проходят трижды при сохранении в мозге мыши эндотелиальной клетки (mBEC) среднего II. Крауч и Doetsch20 предложить метод очистки перицитов FACS. Образцы тканей из коры головного мозга и желудочковой зоны мозга мыши микро-расчленены и тщательно измельчаются скальпелем. После коллагеназа / диспазы инкубации фермента в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию, переваренные ткани отделяется от миелина и мусора центрифугированных в 22% v/v Percoll раствор. Суспензия клетки затем инкубируется в флуоресцентно спряженным антителам для анализа FACS и сортировки. Отсортированные клетки покрыты коллагеном покрытием скважин 24 хорошо пластины. Предполагается, что одна кора дает достаточно ежеклеток для одного покрытия в 1 скважине из 24-колодца пластины.
Даже если эти методы продуктивны, эти методы поставляются с несколькими ограничениями, от использования большого количества животных для односерийной изоляции до очень ограниченного количества выходных данных.
За время разработки предлагаемого протокола нам удалось получить высокую мощность: 9 скважин из 6-колодца пластины от 10 мышей. С этой целью удаление оленей обеспечивает одноступенчатое удаление крупных сосудов из ткани. Дробилка Dounce ткани больше подходит для мягких тканей, таких как мозг. Он также обеспечивает сокращение образцов с рыхлым пестиком, гомогенизация с жесткой пестик, и предотвращает ненужные повреждения клеток. Одной из основных целей в протоколах первичной культуры клеток является минимальная трата тканей и длительное извлечение сосуды головного мозга. В представленном протоколе это достигается путем повторного центрифугирования экстран-BSA проникнутой ткани гомената. Трехступенчатый подход центрифугирования помогает восстановить большое количество сосудизмовизм из ткани гомегената. Это обеспечивает 3x улучшенное восстановление микросудов. После разделения, фильтрация является следующим важным шагом, который выступает за исключение гладкой мышечной клетки связанных крупных сосудов. Как уже упоминалось ранее сочетание различных ферментов было предложено для ферментативного пищеварения. В то время как DNase и коллагенеза / диспазы используются для уменьшения скоплений клеток и изолировать одиночные клетки соответственно, это очень важно, чтобы предотвратить гибель клеток в такой инвазивной среде, и это предотвращается TLCK, что тем самым увеличивает конечную урожайность. Первоначально, первый проход позволен для того чтобы вырасти endothelial monolayer, который более поздно поддерживает рост прикрепленных перицитов на unilayer. Так как выживание первичных эндотелиальных клеток уменьшается при прохождении, это повышает вероятность извлечения перицита. Кроме того, этот протокол использует еще один проход, который обеспечивает предотвращение эндотелиального загрязнения клеток. Следует отметить, что при большем количестве клеток из P2 зависимость от дальнейшего прохождения клеток уменьшается. Кроме того, это уменьшает возможность роста перицита обгоняют гладкие мышечные клетки, которые распространяются на гораздо более высокой скорости.
Для достижения более высокой производительности, Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение и должны быть точно выполнены в отношении температуры и времени. Смешивание ткани гомегената в BSA-dextran должно быть быстрым. Диссоциация гранул после этапов центрифугации должна быть быстрой, чтобы предотвратить гибель клеток. Кроме того, 33 мин ферментативного пищеварения должно быть сделано с точностью и осторожностью. Одним из ограничений для этого протокола является 7-8-дневный срок, что эндотелиальный unilayer разрешено расти и далее способствовать росту перицитов. Очевидно, что изоляция микрососудов является btter, рост unilayer быстрее, и, следовательно, Есть увеличение числа перицитов. Рекомендуется не использовать менее 10 мышей в каждой экстракции для обеспечения достаточного количества микрососудистых фракций для дальнейшего роста перицитов. Если следует ежектовая точкам внимательно, то желаемая плотность клеток для культуры перицита головного мозга может быть легко достигнута.
Модели In vitro обеспечивают осуществимую платформу для разработки производных моделей для получения дополнительной информации о патофизиологической значимости и коммуникации между другими клетками НВУ во время неврологических расстройств. Изолированные перициты могут быть включены в двухклеточной культуры (с эндотелиальных или глиальных клеток) и трехклеточной культуры (эндотелиальных и глиальных клеток) моделей. Разработка этих моделей здесь не обсуждалась. В заключение, этот протокол обеспечивает один подход для изоляции первичных клеток с более высоким выходом и лучшую платформу для исследования in vitro, связанные с биологией церебральных перицитов.
The authors have nothing to disclose.
LT и FG были предоставлены Национальным агенством речерче (ANR, ANR-15-JPWG-0010) в рамках Совместной программы ЕС – Neurodegenerative Disease Research (JPND) для проекта SNOWBALL.
Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
Dextran | Sigma | 31398 | |
DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
Equipment Requirements | |||
Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
Water bath with agitator | |||
Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
Pestle I: 0.0035 – 0.0065 inches | |||
Pestle II: 0.0010 – 0.0030 inches | |||
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |