אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.
בשנים האחרונות הפכו כיום למרכז מחקר נרחב בביולוגיה ובפתולוגיה של כלי הדם. החשיבות של קרום הלב במבנה מחסום הדם והפיזיולוגיה מומחש כעת, אך הבסיס המולקולרי שלו נותר ברובו לא ידוע. כתפקיד הפתופסולוגי של קרום הלב המוחית בהפרעות נוירולוגיות מרתקת ובעלת חשיבות רבה, מודלים בלתי מתורבת לא רק מתאים מספיק אלא גם מסוגל לשלב טכניקות שונות למחקרים אלה. מספר שיטות הוצעו כמודלים של מבחנה להפקת קרום הלב, למרות שפרוטוקול ללא אנטיביוטיקה עם תפוקה גבוהה רצוי. החשוב ביותר, שיטה כי יש מוגברת תפוקה לכל החילוץ מפחית את השימוש של בעלי חיים נוספים.
כאן, אנו מציעים שיטה פשוטה ויעילה להפקת קרום הלב מוחין עם תפוקה גבוהה מספיק. רקמת המוח העכבר המגון מעורבב עם פתרון BSA-dextran להפרדה של פסולת רקמות וכלה מיקרונימי. אנו מציעים הפרדה של שלושה צעדים ולאחר מכן סינון כדי להשיג filtrate עשיר מיקרוכלי. עם שיטה זו, את כמות שברי מיקרוכלי דם שהתקבלו מ 10 עכברים מספיק זרעים 9 בארות (9.6 ס מ2 כל אחד) של צלחת 6-היטב. מעניין ביותר עם פרוטוקול זה, המשתמש יכול להשיג 27 בארות עשיר כלציט (9.6 ס מ2 כל אחד) במעבר 2. הטוהר של התרבויות לקרום הלב מאושרות עם ביטוי של סמנים לקרום הלב הקלאסי: NG2, PDGFR-β ו CD146. שיטה זו ממחישה את הכלי היעיל והריאלי לחקר החוץ של המחקרים הפיזיולוגיים והפתופיזילוגיים על כקרום הלב.
קרום הלב הם מרכיב חיוני של היחידה נוירונימי (NVU), אשר כוללת יחידה תפקודית עם תאי המוח מוחין של מכשול המוח בדם (BBB), תאי גליה, מטריקס מטריתאי ונוירונים. כולציטים הם חלק חיוני בתפקוד מוסדר של מערכת העצבים המרכזית (CN) כפי שהם משמשים כאחד הממשקים עבור חילופי מידע מולקולרי ותאי.
קרום המוח מוטבע בצד האבלומיאלי של כלי המיקרו-כלים, והם חיוניים להקמת1 ולשמירה על2 הפיזיולוגיה של bbb. מספר יצירות האחרונות הדגישו גם את תפקידה של קרום הלב המוח באנגיוגנזה3 והתבגרות הספינה4, אנדותל מורבגנזה5 והישרדות6, ובשליטה על מטבוליזם המוח כולסטרול7. וחשוב מכך, הדיסרגולציה בכל אחד מהתהליכים הללו מהווה הסימנים ההיכר של מחלות ניווניות.
אכן, קרום הלב הם הכרח פונקציונלי לתפקוד BBB נורמלי והגנה שלה מפני ההתקדמות של מחלות נוירולוגיות מספר. הפיזיולוגיה וההפסד של קרום המוח הם המכנה המשותף של מחלת האלצהיימר8, אובדן עצבי במהלך בתפקוד החומר הלבן9, טרשת נפוצה10, ספיגה אנצפלופתיה11, בשלב אקוטי שבץ מוחי12 ובהפרעות נוירולוגיות אחרות. קרום הלב הם גם אינסטרומנטלי הגידול גרורות13. מעניין, קרום הלב הוכחו גם להפגין תפקיד החילוץ לאחר טראומה והפרעות נוירולוגיות: ב reמיאלונציה במוח1, משיחת איסכמי, פגיעה בחוט השדרה14 וקידום אנגיוגנזה15. הרגישות של קרום הלב כדי לחזק את הביטוי הפתופסולוגי של טראומה נוירולוגית והפרעות הופך אותם מטרה טיפולית פוטנציאלית16.
במודלים של מחקר בתחום הפריולוציטים בבית BBB הם כלים חשובים לניהול מחקרים נרחבים. מודלים אלה מספקים פלטפורמה למחקרים משוכללים יותר על ידי ייצוג דגמי העבודה של BBB ועוד. לדוגמה, ניתן להשתמש במודלים אלה כדי להבין את הפיזיולוגיה התאית בתוך קרום הלב ובין סוגי תאים אחרים של NVU. כמו כן, במודלים של חוץ גופית הם כלי חקירה ממקור ראשון לבדיקת ההשפעה הפרמקולוגית של תרופות חדשות ומולקולות על כלציטים. מודלים אלה יכולים לשמש גם כדי להבין את התפקיד הפתופסולוגי של קרום הלב ביחס להפרעות נוירולוגיות. למרות זאת, התפתחות במודלים של מבחנה דורשת תפוקה מוגברת כדי לאפשר חופש ניסיוני. מודלים אלה אמורים להיות קלים ומהירים, ולהקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות. בנוסף, היכולת לפתח מודלים כאלה לתוך מודלים של תרבות תא כפול ומשולש רצוי.
קיימים פרוטוקולים רבים שפותחו. הפרוטוקולים המוצעים על ידי תיגבור ואח ‘17, חן ואח ‘18, תומסן ואח ‘19, יאצאקי ואח ‘20, ו קראוץ ‘ ו doetsch21 הם גישות ראוי לספק את רוב הצרכים. כל השיטות הללו מפיקות תוצאות אפקטיביות, אך התלות במספר רב של בעלי חיים ניסיוניים נותרה מכנה משותף לפרוטוקולים אלה. לכן, זה הופך להיות הכרחי כדי לפתח שיטת פלט גבוהה שיכולה לבודד ולטהר את קרום הלב עם היעילות המירבית האפשרית. בפרוטוקול זה, טוהר התאים שהתקבלו לאחר מעבר שני מאומת עם מספר סמנים לקרום הלב. בדקנו עבור טסיות נגזר מקדם הצמיחה קולטן-β (PDGFR-β), אשר משמש כסמן קלאסי של קרום הלב17, ועבור NG2 (תא העצב-glial אנטיגן 2), שהוא סמן של כריתת קרום המוח בתיווך מורפולגנזה22 ו vascularization23. בדקנו גם עבור אשכול של בידול 146 (CD 146), אשר דווחה כאחת המולקולות מבוטא בקרום הלב17,18.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת קרום הלב העיקרי מעכברים (סוג פראי או transgenics) כי יספק את כל הדרישות הנ ל עם תפוקה גבוהה. אנו מעסיקים אנטיביוטיקה וimmunopanning שיטה מבוססת בחירה חינם של התפשטות עבור קרום הלב הראשי המוח, אשר יוכיח את עצמו מודל יעיל לניהול לימודי מבחנה.
קרום הלב מוחין הוא חלק אינטגרלי של NVU ולשחק תפקיד פעיל אינדוקציה ותחזוקה של BBB24. באופן דומה, התפקיד של תאים אלה בהפרעות ניווניות שונים הפתווגיות כלי דם הוא מסקרן. מכאן, מודל תא מרכזי להפקת פלט יעיל יספק פלטפורמה יעילה למחקרים בעלי מבחנה.
ישנם פרוטוקולים שונים שהוצעו לבידוד של קרום הלב העיקרי (איור 4). טיגס ואח ‘17 הציע שיטה כולל רקמה קורטיקלית עם מניגס. גישה זו היא הטפיקציה של רקמות מ 6 עכברים (37 ° c, 70 דקות העיכול עם אנזימים papain/DNase) ואחריו צעד התפוררות באמצעות 21 G ו 18 G מחטים. פרוטוקול זה מציע הפרדה של צעד אחד (צנטריפוגה בתוך 22% BSA/ערוץ PBS) התשואות לפחות 2 קולגן אני מצופה בארות של צלחת 6-היטב. התאים מתוחזקים במדיום צמיחת התאים האנדותל (ECGM) עד מעבר 3 ומאוחר יותר באמצעי גדילה (PGM) עבור תאי המעבר כדי לקדם התפשטות כריתת קרום המוח. בגישה דומה אחרת, צ’ן ואח ‘18 הדיסוציאציה של רקמת העור על ידי קוצצת את הרקמה עם להב תער מעוקר ואת העיכול רקמות עם קולגן וכלי/dnase עבור 90 דקות ב 37 ° c. בעקבות הפרדה של צעד אחד (צנטריפוגה ב -22% BSA) של התאים, שכבת המיאלין מוסרת והגלולה נשטפה פעמיים ב-ECGM. כלי המיקרו מצופים ב -3 בארות של קולגן שאני מכוסה בצלחות בנות 6. לאחר שהגיעו למפגש, התאים מגיעים פעמיים ומאוחר יותר מתוחזקים PGM. בסופו של דבר, אם התאים מועברים ביחס של 3, אנחנו יכולים להשיג 27 וולס של לוחיות 6-טוב רק בשימוש של 10 עכברים בתחילת הפרוטוקול.
בתומסן ואח ‘, המחברים ממליצים על בידוד קרום הלב של המוח באמצעות העיכול האנזים בעל שני השלבים19. . ודגימות מוח נחתכו לחתיכות קטנות החלקים רקמה לעבור את תגובת האנזים הראשון ב-כלקולאז/DNase I עבור 75 דקות ב 37 ° c, בעקבות צעד אחד של הפרדה 20% BSA. הגלולה נאסף ועוד מתעכל ב-קולגן/dispase/DNase I עבור 50 דקות ב 37 ° c. שלב זה מלווה בהפרדה של 33% חלחול ושטף עוד פעם אחת. כלי המיקרו מצופים במנות מצופות 35 מ”מ בקולגן הרביעי/fibronectin. התפשטות קרום הלב היא המועדף על 10% FCS ו gentamicin סולפט ב DMEM עבור 10 ימים. בגישה נוספת לעיכול של שני צעדים, יאמאצאקי ואח ‘. מראים מחדש את הרקמההמחפירהב-dmem הקרה. בתגובת האנזים הראשון, הדגימות מטופלות עם הקולאז/DNase I עבור 75 דקות ב 37 ° c. בעקבות צעד אחד צנטריפוגה, את הגלולה הוא שטף שוב פעם אחת תגובת האנזים השני הוא יזם בשנת הקולגן/dispase עבור 60 דקות ב 37 ° c. בעקבות הפרדה של צעד אחד, הגלולה הוא מושעה מחדש ו centrifuged בפתרון BSA 22%. לבסוף, הגלולה מיקרוכלי דם מושהה. ומצופה בצלחת של 6 מטרים עבור 5 מוחות העכבר, 1 טוב של צלחת 6-באר יכול להיות מצופה. כדי להשיג את קרום הלב, תרבויות אנדותל הם החוצה שלוש פעמים בזמן שנשמר במוח העכבר תא אנדותל (mBEC) בינונית II. קראוץ ‘ ו Doetsch20 מציעים שיטת טיהור כלציט על ידי facs. דגימות רקמה מקליפת המוח-אזור תת-חדרית של מוחי העכבר הם מיקרו-גזור ובטחון ביסודיות עם אזמל. לאחר הקולגן/הדגירה האנזים במשך 30 דקות ב 37 ° c, הרקמה מתעכל מופרד מאלין ופסולת centrifuged ב 22% v/v הפתרון חלחול. השעיית התא הוא לאחר מכן מודענב נוגדנים מצובזות בשנת פלואורוסקופים ניתוח ומיון של FACS. התאים ממוינים מצופה קולגן מצופה בארות של 24 צלחת הבאר. הוא הציע כי קליפת אחד מניב מספיק תאים עבור ציפוי אחד ב 1 היטב של צלחת 24.
גם אם פרודוקטיבי, שיטות אלה מגיעות עם מספר מגבלות, מן השימוש של מספר רב של בעלי חיים עבור בידוד אצווה אחת כמות מוגבלת מאוד של פלט.
במהלך הפיתוח של הפרוטוקול המוצע, הצלחנו להשיג תפוקה גבוהה: 9 בארות של צלחת 6-היטב מתוך מעטים כמו 10 עכברים. למטרה זו, הסרת הקרום מבטיח את ההסרה צעד אחד של כלי גדול מן הרקמה. מטחנת הרקמה של הדיאונקיה מתאימה יותר לרקמות רכות כגון המוח. הוא גם מבטיח הפחתת דגימה עם הפילינג הרופף, הומוגון עם הפסל הצמוד, ומונע נזקים סלולאריים מיותרים. אחת המטרות העיקריות בפרוטוקולי תרבות התא הראשוני היא בזבוז מינימלי של רקמות ושליפה מורחבת של ואצלב המוח. בפרוטוקול המוצג, זה מושגת על ידי צנטריפוגה חוזרים של dextran-BSA רקמה המרקמת העור אכל. גישה שלושה שלבים צנטריפוגה מסייעת לשחזר כמויות גדולות של ואצלב מן רקמת המגון ate. זה מספק 3x התאוששות משופרת של כלי מיקרו. בעקבות הפרדה, סינון הוא הצעד החיוני הבא, אשר מעדיף את החרגה של תא שריר חלק הקשורים כלי גדול. כפי שהוזכר לפני שילוב של אנזימים שונים הוצע לעיכול אנזימטי. בעוד DNase ו הקולגן/dispase משמשים כדי להפחית את הגושים של תאים ולבודד תאים יחיד בהתאמה, חשוב מאוד למנוע מוות של תאים בסביבה פולשנית כגון זה מונע על ידי TLCK, אשר ובכך מגביר את התשואה הסופית. בתחילה, המעבר הראשון מותר לגדל מונאולייר אנדותל, שמאוחר יותר תומך בצמיחת קרום הלב הצמוד בunilayer. כיוון שהישרדותה של תאי האנדותל הראשוניים מופחתת על-ידי הפסחתה, היא מגבירה את ההסתברות לאיחזור כדוריות דם. כמו-כן, פרוטוקול זה מעסיק מעבר נוסף המבטיח הימנעות מזיהום תאי האנדותל. יש לציין כי עם מספר גבוה יותר של תאים מ P2, את התלות בהמשך ההתיישנות של התאים מופחת. בנוסף, הוא מפחית את האפשרות של צמיחה קרום המוח שהוא השיג בתאי שריר חלקה, אשר מתרבים בקצב גבוה בהרבה.
על מנת להשיג תפוקה גבוהה יותר, ישנם מספר שלבים קריטיים ויש לבצע אותם באופן מדויק ביחס לטמפרטורה וזמן. ערבוב של רקמת הומוזה לתוך BSA-dextran צריך להיות מהיר. הדיסוציאציה גלולה לאחר השלבים צנטריפוגה צריך להיות מהיר כדי למנוע מוות תאים. יתר על כן, 33 מינימום של עיכול אנזימטי צריך להיעשות בדיוק ובטיפול. אחת המגבלות עבור פרוטוקול זה היא המשך היום 7-8 שunilayer אנדותל מותר לצמוח ולהקל עוד יותר את התפתחותם של קרום המוח. ככל הנראה, הבידוד של כלי הדם הוא btter, הצמיחה של unilayer הוא מהיר יותר, ולכן יש מספר מוגבר של קרום הלב. מומלץ לא להשתמש פחות מ 10 עכברים בכל חילוץ כדי להבטיח מספר הולם של שברים microvascular כדי לתמוך בצמיחה קרום הלב עוד. אם הנקודות הנ ל מעקב בזהירות, צפיפות התא הרצויה עבור תרבות קרום המוח ניתן להשיג בקלות.
במודלים של חוץ גופית מספקים פלטפורמה אפשרית לפיתוח מודלים נגזרים לקבלת מידע נוסף על הרלוונטיות הפתופסולוגית ותקשורת בין התאים האחרים של NVU במהלך הפרעות נוירולוגיות. ניתן לשלב בין כדוריות הקרום הבודדות בתרבות דו-תאית (עם תאי אנתל או גליאל) ובתרבות תלת-תאית (תאי האנדותל וגליאל). התפתחות מודלים אלה לא נדונה כאן. לסיכום, פרוטוקול זה מספק גישה אחת לבידוד של תאים ראשוניים עם תפוקה גבוהה יותר ופלטפורמה טובה יותר למחקר מתורבת הקשור לביולוגיה מוחית קרום הלב.
The authors have nothing to disclose.
LT ו-FG ניתנו על ידי סוכנות הידיעות הלאומית דה לה רצ’רצ’ה (ANR, ANR-15-JPWG-0010) במסגרת התוכנית המשותפת של האיחוד האירופי – מחקר מחלת ניווניות (JPWG) עבור פרויקט כדור שלג.
Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
Dextran | Sigma | 31398 | |
DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
Equipment Requirements | |||
Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
Water bath with agitator | |||
Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
Pestle I: 0.0035 – 0.0065 inches | |||
Pestle II: 0.0010 – 0.0030 inches | |||
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |