نحن نقدم بروتوكول لاستخراج العجانات الدماغية murine. استنادا إلى التخصيب الخالي من المضادات الحيوية استخراج perسيلات المنحى ، وهذا البروتوكول هو أداه قيمه للدراسات في المختبر توفير عاليه النقاء والغلة العالية ، التالي خفض عدد الحيوانية التجريبية المستخدمة.
في السنوات الاخيره ، أصبحت بيريسيلات الدماغية بؤره البحث المستفيض في علم الاحياء الوعائية وعلم الامراض. ويتضح الآن اهميه pericytes في تكوين حاجز الدم في الدماغ وعلم وظائف الفسيولوجية ولكن الأساس الجزيئي لها لا يزال مجهولا إلى حد كبير. كما دور الفيزيولوجيا المرضية من بيريسيلات الدماغية في الاضطرابات العصبية هي مثيره للاهتمام وذات اهميه كبيره ، والنماذج في المختبر ليست فقط مناسبه بما فيه الكفاية ولكن أيضا قادره علي دمج تقنيات مختلفه لهذه الدراسات. وقد اقترحت عده طرق كما في نماذج المختبر لاستخراج بيريسيلات الدماغية, علي الرغم من ان بروتوكول خاليه من المضادات الحيوية مع ارتفاع الإنتاج هو مرغوب فيه. والاهم من ذلك ، فان الطريقة التي زادت الإنتاج لكل استخراج يقلل من استخدام المزيد من الماشية.
هنا ، نقترح طريقه بسيطه وفعاله لاستخراج pericytes الدماغي مع الإنتاج العالي بما فيه الكفاية. يخلط انسجه المخ الدماغ الخالط مع محلول الجيش الصربي-ديكبرين للفصل بين الحطام الانسجه وبيليه الاوعيه الدموية المجهرية. نقترح الانفصال ثلاث خطوات تليها الترشيح للحصول علي الترشيح الصغيرة الغنية الاوعيه. مع هذا الأسلوب ، كميه من شظايا الاوعيه الدقيقة التي تم الحصول عليها من 10 الفئران كافيه للبذور 9 الآبار (9.6 سم2 كل) من لوحه 6 جيدا. الأكثر أثاره للاهتمام مع هذا البروتوكول ، يمكن للمستخدم الحصول علي 27 الآبار pericyte الغنية (9.6 سم2 لكل) في مرور 2. يتم تاكيد نقاء الثقافات perسيلات مع التعبير عن علامات pericyte الكلاسيكية: NG2 ، PDGFR β و CD146. هذا الأسلوب يوضح أداه فعاله ومجديه في المختبر للدراسات الفسيولوجية والفيزيولوجيا المرضية علي perسيلات.
بيريسيلات الدماغية هي عنصر أساسي من وحده الاوعيه الدموية (NVU) ، والذي يضم وحده وظيفية مع الخلايا الغشائية الدماغية من حاجز الدم في الدماغ (BBB) ، والخلايا الددميه ، والمصفوفة خارج الخلية والعصبية. Pericytes هي جزء حيوي في العمل المنظم للجهاز العصبي المركزي (CNS) لأنها بمثابه واحده من واجات لتبادل المعلومات الجزيئية والخلوية.
وجزءا لا يتجزا من pericytes الدماغية في الجانب abluminal من الاوعيه الدقيقة الدماغ, وضرورية لإنشاء1 والحفاظ علي2 الفيزيولوجيا BBB. وقد أبرزت العديد من الاعمال الاخيره أيضا دور بيريسيلات الدماغية في الاوعيه3 ونضج السفينة4, البطانية تخلق5 والبقاء علي قيد الحياة6, وفي السيطرة علي استقلاب الكولسترول في الدماغ7. والاهم من ذلك ، فان خلل التنظيم في اي من هذه العمليات هي السمات المسببة للامراض التنكسية العصبية.
في الواقع ، pericytes هي ضرورة وظيفية للأداء العادي BBB وحمايتها ضد تطور العديد من الامراض العصبية. توليد الوظائف الفسيولوجية وفقدان pericytes هي القواسم المشتركة في تطور مرض الزهايمر8, فقدان الخلايا العصبية خلال ضعف المادة البيضاء9, التصلب المتعدد10, اعتلال الدماغ التفسخ11, السكتة الدماغية الحاده المرحلة12 وفي الاضطرابات العصبية الأخرى. Pericytes هي أيضا مفيده في ورم خبيث13. ومن المثير للاهتمام, وقد تبين أيضا pericytes لإظهار دور الإنقاذ بعد الصدمات العصبية والاضطرابات: في أعاده النخاع في الدماغ1, السكتة الدماغية, أصابه الحبل الشوكي14 وتعزيز تولد الاوعيه15. حساسية العجان لتعزيز المظهر المرضي للصدمات العصبية والاضطرابات يجعلها الهدف العلاجي المحتمل16.
في المختبر نماذج البحوث من pericytes في BBB أدوات هامه لاجراء دراسات واسعه النطاق. هذه النماذج توفر منصة للدراسات أكثر تفصيلا من خلال تمثيل نماذج العمل من BBB وأكثر من ذلك. علي سبيل المثال ، يمكن استخدام هذه النماذج لفهم فسيولوجيا الخلوية داخل العجان وبين أنواع الخلايا الأخرى من NVU. أيضا ، في نماذج المختبر هي أدوات التحقيق مباشره لاختبار التاثير الدوائي للعقاقير الجديدة والجزيئات علي pericytes. ويمكن أيضا ان تستخدم هذه النماذج لفهم الدور الباثولوجي من بيريسيلات فيما يتعلق بالاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فان تطوير النماذج في المختبر يتطلب زيادة الإنتاج لتمكين الحرية التجريبية. وينبغي ان تكون هذه النماذج سهله وسريعة ، والحد من عدد الحيوانية التجريبية المستخدمة. الاضافه إلى ذلك ، فان القدرة علي تطوير مثل هذه النماذج في نماذج ثقافة الخلايا المزدوجة والثلاثية أمر مرغوب فيه.
هناك العديد من البروتوكولات التي تم تطويرها. والبروتوكولات المقترحة من قبل Tigges et al.17، Chen et al.18، thomsen et al.19، يامازاكي Et Al.20، و كراوتش و doetsch21 هي النهج الجديرة بالثناء التي تلبي معظم الضروريات. كل هذه الأساليب تسفر عن نتائج فعاله ، ولكن الاعتماد علي عدد كبير من الكائنات التجريبية لا يزال قاسما مشتركا لهذه البروتوكولات. ولذلك ، يصبح إلزاميا لتطوير طريقه الإخراج العالية التي يمكن عزل وتنقيه pericytes مع اقصي قدر ممكن من الكفاءة. في هذا البروتوكول ، يتم التحقق من نقاء الخلايا التي تم الحصول عليها بعد مرور الثاني مع عده علامات pericytes. دققنا لمستقبلات عامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية-β (pdgfr-β) ، والذي يستخدم كعلامة كلاسيكية من pericytes17، النسبة لNG2 (العصبية-غليال مستضد 2) ، والذي هو علامة pericytes توسط الاوعيه الدموية تخلق22 والاوعيه23. راجعنا أيضا لمجموعه من التمايز 146 (CD 146) ، التي تم الإبلاغ عنها باعتبارها واحده من الجزيئات التي أعرب عنها في perسيلات17،18.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لاستخراج pericytes الابتدائية من الفئران (نوع البرية أو transgenics) من شانها ان تلبي جميع المتطلبات المذكورة أعلاه مع ارتفاع الإنتاج. نحن نوظف المضادات الحيوية والمناعية الاختيار الحرة القائمة علي طريقه الانتشار لل pericytes الدماغية الابتدائية ، والتي سوف تثبت نفسها نموذجا فعالا لاجراء الدراسات في المختبر.
بيريسيلات الدماغية هي جزء لا يتجزا من NVU وتلعب دورا نشطا في الحث والصيانة من BBB24. المثل ، فان دور هذه الخلايا في اضطرابات الأعصاب المختلفة وامراض الاوعيه الدموية مثير للاهتمام. التالي ، فان كفاءه عاليه الإنتاج الابتدائي نموذج خليه pericyte توفير منصة فعاله للدراسات في المختبر.
وهناك بروتوكولات مختلفه اقترحت لعزل العجانات الاوليه (الشكل 4). واقترح tigges وآخرون17 طريقه بما في ذلك الانسجه القشرية مع السحايا. هذا النهج هو العطاء من الانسجه من 6 الفئران (37 درجه مئوية ، 70 دقيقه الهضم مع الانزيمات papain/DNase) تليها خطوه تفكك عبر 21 G و 18 G الابر. يقترح هذا بروتوكول فصل [ان-بست] (طرد في 22% [بوسني]/[ببس] حل) ان غله علي الأقل 2 كولاجين انا يكسو بئر من 6 بئر لوحه. ويتم الحفاظ علي الخلايا في متوسط نمو الخلايا البطانية (ECGM) حتى مرور 3 وفي وقت لاحق في المتوسط النمو بيريسيلات (PGM) لخلايا العبور لتعزيز انتشار بيريسيلات. وفي نهج مماثل آخر ، اقترح تشن وآخرون18 التفكك الانسجه عن طريق التعامل مع الانسجه مع شفره الحلاقة المعقمة والهضم الانسجه مع كولاجيناسي/dnase ل 90 دقيقه في 37 درجه مئوية. بعد فصل خطوه واحده (طرد في 22 ٪ بوسني) من الخلايا ، يتم أزاله طبقه الميلين ويغسل بيليه مرتين في ECGM. يتم طلاء الاوعيه الدقيقة في 3 ابار من الكولاجين انا المغلفة لوحات 6-حسنا. بعد الوصول إلى التقاء ، يتم الاحتفاظ بالخلايا مرتين وبعد ذلك في PGM. في النهاية ، إذا تم تمرير الخلايا في نسبه 3 ، يمكننا الحصول علي 27 الآبار من لوحات 6-حسنا فقط في استخدام 10 الفئران في بداية البروتوكول.
في Thomsen وآخرون ، يقترح المؤلفون عزل العجان الدماغي عن طريق هضم انزيم من خطوتين19. يتم أزاله السحايا والمادة البيضاء ، ويتم قطع عينات الدماغ إلى قطع صغيره. الأجزاء الانسجه الخضوع للتفاعل الانزيم الأول في كولاجيناسي/DNase ط ل 75 دقيقه في 37 درجه مئوية ، بعد خطوه واحده من الانفصال في 20 ٪ جيش الصرب البوسني. يتم جمع بيليه ومزيد من هضمها في كولاجيناز/ديداز/DNase انا ل 50 min في 37 ° c. ويتبع هذه الخطوة عن طريق فصل الاوعيه الدقيقة في التدرج Percoll 33 ٪ وكذلك غسلها مره واحده. يتم بذر الاوعيه الدقيقة علي الكولاجين IV/fibronectin المغلفة 35 مم الاطباق. ويفضل انتشار البيرولات بنسبه 10 ٪ FCS وسلفات جنتاميسين في DMEM لمده 10 أيام. في نهج آخر من خطوتين انزيم الهضم, Yamazaki وآخرون اقتراح التنميق من الانسجه المثيرة في DMEM20الباردة. في تفاعل الانزيم الأول ، يتم التعامل مع عينات مع كولاجيناسي/DNase انا ل 75 دقيقه في 37 درجه مئوية. بعد خطوه واحده طرد ، يتم غسلها مره أخرى بيليه مره واحده ويبدا رد فعل الانزيم الثاني في كولاجيناز/ديداز ل 60 دقيقه في 37 درجه مئوية. وبعد الانفصال بخطوه واحده ، يعاد تعليق البيليه وطرد في حل 22 في المائة من الجيش الصربي البوسني. وأخيرا ، يتم أعاده تعليق بيليه الاوعيه الدموية المجهرية ومطلي في لوحه 6-حسنا. ل 5 أدمغه الماوس ، 1 جيدا من لوحه 6-حسنا يمكن ان تكون مطليه. للحصول علي pericytes ، يتم تمرير الثقافات البطانية ثلاث مرات في حين الحفاظ عليها في الخلية الدماغية الدماغ البطانية (mBEC) المتوسطة الثاني. كراوتش و Doetsch20 تشير pericyte طريقه تنقيه من قبل facs. عينات الانسجه من القشرة والبطين – منطقه البطين من الدماغ الماوس هي الصغرى تشريح ومفروم تماما مع مشرط. بعد حضانة انزيم كولاجيناز/ديداز لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية ، يتم فصل الانسجه المهضومة عن الميالين والحطام طرد في محلول Percoll v/v بنسبه 22%. ثم يتم احتضان تعليق الخلية في الأجسام المضادة فلوريسسينتلي مترافق ل FACS التحليل والفرز. يتم طلاء الخلايا التي تم فرزها في الآبار المغلفة الكولاجين من 24 لوحه جيدا. ومن المقترح ان القشرة واحده تعطي ما يكفي من الخلايا لطلاء واحد في 1 بئر من لوحه 24 بئر.
حتى لو كانت منتجه ، هذه الأساليب تاتي مع عده قيود ، من استخدام عدد كبير من الماشية لعزل دفعه واحده إلى كميه محدوده جدا من الإنتاج.
خلال تطوير هذا البروتوكول المقترح ، كنا ناجحين في الحصول علي الإنتاج العالي: 9 ابار من 6-بئر لوحه من عدد قليل من 10 الفئران. ولهذا الغرض ، فان أزاله السحايا تضمن أزاله الاوعيه الكبيرة من الانسجه بخطوه واحده. مطحنه الانسجه داونصه هو أكثر ملاءمة للانسجه الرخوة مثل الدماغ. كما يضمن الحد من العينة مع المدقه فضفاضة ، والتجانس مع مدقه ضيق ، ويمنع الضرر الخلوية غير الضرورية. واحده من الأهداف الرئيسية في بروتوكولات ثقافة الخلايا الاوليه هو الحد الأدنى من النفايات من الانسجه واسترداد موسعه من الاوعيه الدموية الدماغية. في البروتوكول المعروض ، يتم تحقيق ذلك من خلال الطرد المتكررة من الانسجه المتجانسة التي غرست في النسيج. نهج طرد من ثلاث خطوات يساعد علي استعاده كميات كبيره من الاوعيه الدموية من الانسجه المتجانسة. وهذا يوفر الانتعاش 3x تعزيز الاوعيه الدقيقة. بعد الانفصال ، الترشيح هو الخطوة الاساسيه التالية ، التي تفضل استبعاد الخلايا العضلية الملساء المرتبطة بالاوعيه الكبيرة. كما ذكر قبل مزيج من الانزيمات المختلفة وقد اقترح للهضم الانزيمي. في حين يتم استخدام DNase و collagenase/الاستغناء للحد من كتل من الخلايا وعزل الخلايا المفردة علي التوالي ، فمن المهم جدا لمنع موت الخلايا في مثل هذه البيئة الغازية ويتم منع هذا من قبل TLCK ، مما يزيد من العائد النهائي. في البداية ، يسمح للممر الأول ان ينمو أحادي الطبقة البطانية ، والذي يدعم في وقت لاحق نمو العجانات المرفقة علي الانفرادي. منذ البقاء علي قيد الحياة من الخلايا البطانية الاوليه عند المرور ، فانه يعزز احتمال لاستخراج pericyte. وعلاوة علي ذلك ، يستخدم هذا البروتوكول مرور آخر يضمن تجنب تلوث الخلايا البطانية. وتجدر الاشاره إلى انه مع وجود عدد أكبر من الخلايا من P2 ، يتم تقليل الاعتماد علي مزيد من المرور من الخلايا. الاضافه إلى ذلك ، فانه يقلل من امكانيه النمو pericyte التي تجاوزتها خلايا العضلات الملساء ، والتي تتكاثر علي معدل اعلي بكثير.
من أجل تحقيق إنتاج اعلي ، هناك العديد من الخطوات التي هي حاسمه ويجب ان يتم تنفيذها بدقه فيما يتعلق بدرجه الحرارة والوقت. يجب ان يكون خلط الانسجه المتجانسة في الجيش الصربي البوسني-ديدككان سريعا. التفكك بيليه بعد الخطوات طرد ينبغي ان تكون سريعة لمنع موت الخلايا. وعلاوة علي ذلك ، يجب ان يتم 33 دقيقه من الهضم الانزيمي بدقه وعناية. واحده من القيود لهذا البروتوكول هو 7-8 المدة اليوم الذي يسمح الأحادي البطانية للنمو وزيادة تسهيل نمو العجان. ومن الواضح ان عزله الاوعيه المجهرية هي بوتر ، ونمو الأحادي أسرع ، التالي هناك عدد متزايد من العجانات. فمن المستحسن عدم استخدام اقل من 10 الفئران في كل استخراج لضمان عدد كاف من كسور الاوعيه الدقيقة لدعم النمو perسيلات أكثر من ذلك. إذا تم اتباع النقاط المذكورة أعلاه بعناية ، يمكن تحقيق كثافة الخلية المطلوبة للثقافة pericyte الدماغية بسهوله.
في نماذج المختبر توفير منصة ممكنة لتطوير نماذج مشتقه للحصول علي مزيد من المعلومات حول الاهميه المرضية والاتصالات بين الخلايا الأخرى من NVU خلال الاضطرابات العصبية. ويمكن دمج العجانات المعزولة في الثقافة الخلوية الثنائية (مع الخلايا البطانية أو الحلزونية) والثقافة الخلوية الثلاثية (الخلايا البطانية والكريات الدخليه). ولم تتم مناقشه تطوير هذه النماذج هنا. وفي الختام ، يوفر هذا البروتوكول نهجا واحدا لعزل الخلايا الاوليه ذات الإنتاج الأعلى ومنصة أفضل للبحوث المختبرية المتعلقة بالبيولوجيا المخية الدماغية.
The authors have nothing to disclose.
وقد منحت الوكالة الوطنية للبحوث (ANR, جبوج-0010) في اطار البرنامج المشترك للاتحاد الأوروبي – البحوث المتعلقة بامراض الأعصاب (جبند) لمشروع كره الثلج.
Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
Dextran | Sigma | 31398 | |
DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
Equipment Requirements | |||
Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
Water bath with agitator | |||
Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
Pestle I: 0.0035 – 0.0065 inches | |||
Pestle II: 0.0010 – 0.0030 inches | |||
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |