Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.
Bu makalede, tek bir geçirimli (“derili”) kardiyomiyositi izole etmek ve fonksiyonel çalışmalar yapmak için bir kuvvet ölçme aparatı ve bir motora takmak için gereken adımları açıklıyoruz. Bu çalışmalar kardiyomiyosit sertliği ölçümü (pasif kuvvet) ve farklı kalsiyum (Ca2 +)içeren çözeltiler ile belirlenmesine olanak sağlayacak, diğerleri arasında: maksimum kuvvet gelişimi, myofilament Ca2+duyarlılık (pCa50),cooperativity (nHill) ve kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr). Bu yöntem aynı zamanda doğrudan miyofilamentler üzerinde etkili olan ilaçların etkilerinin belirlenmesini ve eksojen rekombinant proteinlerin kardiyomiyositlerin hem aktif hem de pasif özellikleri üzerine ekspresyonunun belirlenmesini sağlar. Klinik olarak, derili kardiyomiyosit çalışmaları birçok miyokardiyal hastalığın patofizyolojisini vurgulamakta ve miyofilamentleri hedef alan terapötik müdahalelerin etkisinin in vitro değerlendirilmesi ne olanak sağlar. Bu teknik, açık kalp veya nakil cerrahisi sırasında elde edilen hayvan modellerinde in vitro ve in vivo parametreleri ile insan dokusu arasındaki korelasyonları araştırarak kardiyak patofizyolojinin açıklığa kavuşturulmasını sağlar.
Geleneksel olarak, miyokardiyal mekanik özelliklerin değerlendirilmesi papiller kaslar ve trabekülae1,2gibi çok hücreli preparatlar, çoğunlukla denenmiştir. Çok hücreli kardiyak kas şeritler hücrelerin heterojen bir nüfus içerir, oryantasyon ve kuvvet üretimi bilinmeyen bir desen ile kontraktil kardiyomiyositler de dahil olmak üzere, elektriksel aktivite ve stres / gerinim dağılımları yanı sıra çevreleyen bağ dokusu matris3,4. Kollajen olmadan bir hazırlık ve tek bir kardiyomiyosit içeren çok hassas ve kontrollü bir şekilde sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü kontraktil özellikleri ölçümü sağlayacak5,6. Bu nedenle, son kırk yılda, çeşitli metodolojiler tek bir kardiyomiyositmekanik,kontraktil ve gevşeme özellikleri incelenmesine izin geliştirilmiştir 6,7. Bu hücrelerin kontraktil fonksiyonu kuvvetle sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü bisiklet kinetikbağlıdır 3. Bu nedenle, sarcomere uzunluğu ve performansının yanı sıra çapraz köprü fonksiyonu ve kontraktil özelliklerinin değerlendirilmesine olanak sağladığı düşünüldüğünde, kas fonksiyonunu doğrudan tek izole kalp hücrelerinde araştırmak istenir. Ancak, μN düzeyinde kuvvet ölçümü kayıt ederken makul bir optik sarcomere çözünürlüğü ile fonksiyonel kardiyomiyositlerin izole edilmesi ve takılması hala zorlu ve gelişmekte olan3,6. Diğer zorluklar, kardiyomiyositleri yeni toplanan biyopsilerden ayırmak için kurulması gereken lojistiktir. Örneğin, insan biyopsilerinin tahmin edilemezliği deneylerin fizibilitesini tehlikeye atabilir.
Ayrıca, bilimsel prosedürler (3R ilkeleri) için hayvan deneyleri Değiştirme, Azaltma ve Arıtma ile ilgili etik kaygılar hücresel ve doku düzeyinde çalışma değişiklikleri teşvik var, tercihen insan biyopsileri, ya da küçük hayvan örnekleri. Gerçekten de karmaşıklığı daha küçük bir düzeyde in vitro kardiyak fonksiyon değerlendirmek için metodolojilerin ilerici bir arıtma tüm vücuda sonuçların uygun entegrasyonu sağlar ve klinik senaryo7bunları çevirmek . Kardiyomiyosit leri çıkarmak için -80 °C’de saklanan numunelerin kullanılması cazip bir alternatif olabilir.
Miyokardiyal doku küçük parçalar halinde kesilir ve bir havan ve bir havaneli ile homojenize edilir. Bu homojenizasyon sonucu sarkolemal hasar değişen derecelerde derili paketlenmiş ve izole hücrelerin bir süspansiyon, miyoplazm banyo ortamına maruz ve tüm hücresel bileşenlerin yıkanır nerede. Sarkoliden daha uzaktaki miyofibriller gibi yapılar korunur. Böylece, sarcomere kısaltma ve miyofibrillar cihaz ile ilişkili fonksiyonel özellikleri bozulmadan tutulur ve 8kaydedilebilir,9.
Kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sistemi, kardiyomiyosit uzunluğunu ayarlamak için kullanılan bir elektromanyetik motor ve izometrik kardiyomiyosit daralmasını ölçen bir kuvvet dönüştürücüden oluşur. Geçirimli veya derili kardiyomiyosit, rahatlatıcı bir solüsyon ([Ca2+] < 10 nM) içeren deneysel bir odaya yerleştirilir ve biri motora, diğeri de kuvvet transdüserine bağlı silikon lu 2 iğneye yapıştırılır. Kardiyomiyosit morfolojisi ve sarcomere uzunluğunu belirlemek için optik sistem kullanılır. Deneysel protokol genellikle farklı Ca2+ konsantrasyonları içeren tampon çözeltiler üzerine bir dizi kuvvet kaydı, aktin-miyozin çapraz köprü kinetiklerinin belirlenmesi ve önceden tanımlanmış sarcomere uzunluklarında atlı kardiyomiyositlerin pasif geriliminin ölçülmesinden oluşur(Şekil 1). Permeabilize kardiyomiyositlerin sıvı nitrojende dondurulmuş miyokardiyal numunelerden (ve daha sonra -80 °C’de depolanan) izolasyonu, kesit alanı başına maksimum Ca2+aktif (aktif) kuvveti (Taktif, kN-m-2), Ca2+-ölçümü için hücresel mekanik ve protein biyokimyası kullanan bir tekniktir. bağımsız(pasif)gerilim (T pasif , kN¡m-2), miyofilamentler Ca2+duyarlılık (pCa50),miyofilamentler cooperativity (nHill), kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr) yanı sıra Taktifsarcomere uzunluk bağımlılıkları , Tpasif, pCa50, nHill ve ktr.
Bu protokolün amacı, kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sisteminin potansiyelini, farklı türlerden gelen dondurulmuş numunelerden izole edilmiş tek derili kardiyomiyositlerin fonksiyonel mekanik özelliklerini değerlendirmek için güvenilir bir prosedür olarak göstermek ve özetlemektir.
Derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun in vitro değerlendirilmesi, fizyolojik (örn. esneme) ve patolojik bağlamda (örneğin, iskemi) kardiyomiyosit düzeyinde meydana gelen değişiklikleri açıklığa kavuşturmak için önemli bir tekniği temsil eder. Bu metodoloji, çözülmüş numunelerden elde edilen kardiyomiyositlerde fonksiyonu değerlendirmek için az miktarda miyokard igerektirecek gibi çeşitli avantajları vardır; türlerin geniş bir yelpazede kardiyomiyositler kullanarak (fareler13, sıçan1,14,15, tavşan16, domuz17, köpek18, kobay19 ve insan20) ve farklı kardiyak yerler, atria dahil, sol ve sağ ventriküller veya enfarktüs kalp belirli bir bölge. Ayrıca, bu teknik, kendi doğal yapılandırmasında düzenleyici ve kontraktil yapıların işlevini ölçerken Ca2 + ve enerji (ATP) belirli konsantrasyonları teslim sağlar.
Bu tekniğin basitliğine rağmen, bazı kritik adımlar vardır. Örnek toplama da dahil olmak üzere, başlangıçtan itibaren her adımın kalitesini garanti etmek esastır. Miyofilament proteinleri proteazlara duyarlıdır21. Bu nedenle numuneleri alındıktan hemen sonra sıvı nitrojende depolamak zorunludur. Daha önce dondurulmamış olan taze numuneler önemli ölçüde daha yüksek kuvvetler geliştirecektir, bu nedenle taze ve dondurulmuş numunelerde yapılan ölçümlerin aynı protokolde karıştırılması tavsiye edilmez. İkinci en kritik adım kardiyomiyositlerin çıkarılmasıdır. Bu işlem sırasında, çoğu zaman buz üzerinde örnek tutmak için çok önemlidir. Bir proteaz inhibitör kokteyl ekstraksiyon / permeabilizasyon sırasında protein bozulması riskini azaltmak için kullanılabilir22. Üçüncü olarak, bu adım göz ardı edildiğinde düşük kaliteli kardiyomiyositler belirttiğimiz için, numuneler hassas neşter hareketleri kullanılarak daha küçük parçalar halinde kesilmelidir. Triton yıkama arasında doğru dengeye sahip zor olduğu için başka bir kritik adım kardiyomiyosit yıkama olduğunu (hücre permeabilize ama ungluing teşvik) ve supernatant mümkün olduğunca çok sayıda hücre tutmak. Öncelikle her örnek, tür veya protokol için ekstraksiyon ve yıkama sayısını denemek önemlidir. Örneğin, elimizde, biz ZSF1 obez sıçan dokusu çıkarmalar yapıştırma sırasında bu hücreleri daha kaygan ama ölçmek için daha zor değil yapılan bir “yağlı” yönü olduğunu kaydetti. Bu sorunu aşmanın yolu, hayvan başına makul sayıda hücreye sahip olmak için daha fazla deney yapmaktı. Ayrıca, tutkal için iyi bir hücre seçmek için çok önemlidir, yani iyi bir striation ve makul uzunluğu ile. Kardiyomiyosit bu özelliklere sahip değilse, çoğunlukla iğne uçlarından kopacak veya no/düşük kuvvet geliştirecektir. Ayrıca kardiyomiyosit eki için doğru tutkal kullanmak önemlidir, yapıştırma zamanı ve iğne hücre yapıştırmak için etkinliğini göz önünde bulundurularak. Elimizde, silikon tutkal(Malzeme Tablosu)hızlı (10-15 dk) ve yeterince güçlü tedavileri. Son olarak, son kritik adım dikkatle hücre yapıştırma sonra kardiyomiyosit 5 dk kaldırma ile ilgilidir (coverslip hücre yapıştırma önlemek için) ve kuyulara taşımadan önce (mikroskop aşaması tarafından sürüklenen hücre önlemek için). Tablo 7, bu teknikle ilişkili sorun giderme olayını, altta yatan nedenleri ve sık karşılaşılan sorunların üstesinden gelmek için olası çözümleri özetler.
Bu yöntemin en önemli sınırlaması, miyofilament kontraktürünün ne kadar hızlı aktivhale/devre dışı bırakılamadığı gibi tüm soruları yanıtlayamamasıdır. In vivo ayarında, membran depolarizasyonu, hücre içi Ca2+ artışı ve miyofilamentlere difüzyonunun miyositlerin kasılması için gerçekleşmesi gerekirken, derili kardiyomiyositlerde Ca2+ miyofilamentlere difüzyon hücre Ca2+ çözeltisine batırıldığında hemen gerçekleşir. Ca2 + difüzyon Bu hızlı oranı aktivasyon / deaktivasyon analizi23miyofilamentler önyargı olacaktır.
Bu deneyler sıcaklık, çözelti pH, mekanik pertürbasyon (bolluk-re-stretch vs bolluk) ve hücre eki prosedürleri (pin kravat vs tutkal), tüm bu değişkenlerin ktr vekuvvetsarcomere uzunluğuna bağlı artış açısından literatür farklılıkları için muhasebe dahil olmak üzere farklı faktörler, etkilenir 4,12.
Tekniğin gelecekteki ilerlemesi, permeabilize kardiyomiyositler yerine sağlam fonksiyonel çalışmalar yapmayı içerir. Bu teknik kardiyomiyositler taze izole (daha önce dondurulmuş değil) güvenme dezavantajı vardır. Doğrudan bu metodoloji ile ilgili olmayan bir diğer önemli konu, ancak önemli ölçüde etkileyebilecek örnek dondurulmuş depolama maksimal dönemi ile ilgilidir. Özellikle, depo süresi boyunca miyofilament bozulma derecesini belirlemek zorunludur (yani, çıkarılan kardiyomiyositlerden elde edilen kaliteli fonksiyonel verileri sağlamak için dondurulmuş numunelerin ne kadar süreyle depolanabileceği).
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT), Avrupa Birliği, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) ve Programa Operacional Factores de Competitividade’ye (COMPETE) UnIC (UID/IC/00051/2013) araştırma birimini finanse ettiği için teşekkür ediyor. Bu proje FEDER tarafından COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), DocNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), Norte Portugal bölgesel operasyonel programı (NORTE 2020) tarafından desteklenen, Portekiz 2020 ortaklık anlaşması kapsamında desteklenmiştir, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF), PROJE NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), Avrupa Yapısal Ve Yatırım Fonları, Lizbon bölgesel operasyonel programı 2020 tarafından desteklenen. Patrícia Rodrigues FCT (SFRH/BD/96026/2013) ve João Almeida-Coelho tarafından finanse edildi Universidade do Porto/FMUP ve FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Acetone | Sigma | 34580 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
Imidazole | VWR | 24720.157 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
Length Controller ( Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
Inverted Microscope (IX51) | Olympus |