يهدف هذا البروتوكول إلى وصف تقنية استخراج وتقييم وظيفة القلب خطوة بخطوة باستخدام خلايا القلب ذات البشرة. تسمح هذه المنهجية بقياس وظيفة myofilament والتحويل الحاد لها باستخدام خزعات صغيرة مجمدة يمكن جمعها من مواقع قلبية مختلفة ، من الفئران إلى الرجال.
في هذه المقالة، نحن وصف الخطوات المطلوبة لعزل واحد permeabilized (“skinned”) cardiomyocyte وإرفاقه إلى جهاز قياس القوة ومحرك لإجراء دراسات وظيفية. وسوف تسمح هذه الدراسات قياس تصلب القلب و القلب (القوة السلبية) وتفعيله مع الكالسيوم مختلفة (كاليفورنيا2+) التي تحتوي على حلول لتحديد، من بين أمور أخرى: الحد الأقصى لتطوير القوة، myofilament كاليفورنيا2 +حساسية (pCa50)،التعاونية (nHill) ومعدل إعادة تطوير القوة (KTR). هذه الطريقة تمكن أيضا من تحديد آثار المخدرات التي تعمل مباشرة على myofilaments والتعبير عن البروتينات المؤتلفة الخارجية على كل من الخصائص النشطة والسلبية للقلب العضلي. سريريا، دراسات cardiomyocyte البشرة تسليط الضوء على الفيزيولوجيا المرضية من العديد من أمراض عضلة القلب والسماح في المختبر التقييم لتأثير التدخلات العلاجية التي تستهدف myofilaments. وإجمالاً، تمكّن هذه التقنية من توضيح الفيزيولوجيا القلبية من خلال التحقيق في الارتباطات بين المعلمات في المختبر وفي الجسم الحي في النماذج الحيوانية والأنسجة البشرية التي يتم الحصول عليها أثناء جراحة القلب المفتوح أو الزراعة.
تقليديا، وقد حاول تقييم الخصائص الميكانيكية عضلة القلب في الغالب في المستحضرات متعددة الخلايا، مثل عضلات الحليمات وtrabeculae1،2. تشمل شرائط عضلات القلب متعددة الخلايا مجموعة غير متجانسة من الخلايا، بما في ذلك خلايا القلب العضلية المتقلصة مع نمط غير معروف من التوجيه وتوليد القوة والنشاط الكهربائي وتوزيعات الإجهاد/السلالات بالإضافة إلى مصفوفة الأنسجة الضامة المحيطة3،4. ومن شأن إعداد دون الكولاجين وتحتوي على cardiomyocyte واحد يسمح قياس طول الساركومير والخصائص العقدية عبر الجسر بطريقة دقيقة جدا وتسيطرعليها 5،6. ولذلك، على مدى العقود الأربعة الماضية، وضعت العديد من المنهجيات التي تسمح التحقيق الميكانيكية، وانكماشية، وخصائص الاسترخاء من القلب واحد6،7. وظيفة العقد من هذه الخلايا تعتمد بقوة على طول الساركومير وعبر الجسر الدراجاتالحركية 3. وبالتالي، فمن المستحسن للتحقيق وظيفة العضلات مباشرة في خلايا القلب المعزولة واحدة، معتبرا أنه يسمح لتقييم طول السارومير والأداء، فضلا عن وظيفة عبر الجسر وخصائص انقبائية. ومع ذلك ، فإن عزل وربط cardiomyocytes وظيفية مع دقة ساركومير بصرية معقولة في حين تسجيل قياس القوة على مستوى μN لا يزال تحديا ومتطورا3،6. التحديات الأخرى هي الخدمات اللوجستية التي تحتاج إلى تثبيت لعزل cardiomyocytes من الخزعات التي تم جمعها حديثا. فعلى سبيل المثال، قد يعرض عدم القدرة على التنبؤ بجمع الخزعات البشرية للخطر جدوى التجارب.
وعلاوة على ذلك، فإن الشواغل الأخلاقية المتعلقة باستبدال التجارب الحيوانية والحد منها وتنقيحها لأغراض الإجراءات العلمية (مبادئ 3Rs) قد شجعت على إجراء تغييرات في الدراسة على مستوى الخلايا والأنسجة، ويفضل أن تكون في الخزعات البشرية، أو في عينات الحيوانات الصغيرة. في الواقع الصقل التدريجي لمنهجيات لتقييم وظيفة القلب في المختبر على مستوى أصغر من التعقيد يسمح التكامل السليم للنتائج إلى الجسم كله وترجمتها إلى السيناريو السريري7. بالإجمال, استخدام العينات المخزنة في -80 درجة مئوية لاستخراج cardiomyocytes قد يكون بديلا جذابا.
يتم قطع الأنسجة عضلة القلب إلى قطع صغيرة ومتجانسة مع هاون وحشرات. نتيجة هذا التجانس هو تعليق من خلايا مُجمّعة ومُعزلة ذات درجات متفاوتة من التلف الساركليمي، حيث يتعرض myoplasm لوسيلة الاستحمام ويتم غسل جميع المكونات الخلوية. يتم الحفاظ على هياكل مثل myofibrils التي هي أبعد من ساركلوما. وهكذا، يتم الاحتفاظ الساركومير تقصير والخصائص الوظيفية المرتبطة جهاز myofibrillar سليمة ويمكنتسجيلها 8،9.
يتكون نظام قياس قوة القلب من محرك كهرومغناطيسي، يستخدم لضبط طول القلب، و محول القوة، الذي يقيس انكماش القلبية متساوي القياس. يتم وضع القلب المثقب ، أو المسلخ ، في غرفة تجريبية تحتوي على حل مريح ([Ca2+] < 10 nM) ولصق السيليكون إلى إبرتين رقيقتين: واحدة تعلق على المحرك والأخرى على محول القوة. ويستخدم نظام بصري لتحديد morphology القلبية وsarcomere الطول. البروتوكول التجريبي غالبا ما يتكون من سلسلة من تسجيلات القوة على حلول العازلة التي تحتوي على مختلف التركيزات كاليفورنيا2 + ، وتحديد حركية عبر الجسر actin – myosin وقياس التوتر السلبي من cardiomyocytes شنت على أطوال ساركومير محددة مسبقا (الشكل 1). عزل القلب العضلي الوعائي المثقب من عينات عضلة القلب المجمدة في النيتروجين السائل (وتخزينها بعد ذلك في -80 درجة مئوية) هي تقنية تستخدم الميكانيكا الخلوية والكيمياء الحيوية البروتينية لقياس أقصى قدر كاليفورنيا2 +تنشيط (نشط) قوة لكل منطقة مقطعية(T نشطة، kN•m -2) ، كاليفورنيا2 +-مستقلة (السلبي) التوتر (Tالسلبي,kN∙m-2),myofilaments Ca2+-حساسية (pCa50),myofilaments التعاونية (NHill), معدل إعادة تطوير القوة (ktr) وكذلك تبعيات sarcomere من Tالنشط,Tالسلبي,pCa50,nHill و KTR.
الهدف من هذا البروتوكول هو توضيح وتلخيص إمكانات نظام قياس قوة القلب و القلبية أوسكوت كإجراء موثوق به لتقييم الخصائص الميكانيكية الوظيفية للقلبيات أحادية البشرة معزولة عن العينات المجمدة من أنواع مختلفة.
في المختبر تقييم وظيفة القلب باستخدام cardiomyocytes البشرة يمثل تقنية هامة لتوضيح التعديلات التي تحدث على مستوى cardiomyocyte في الفسيولوجية (على سبيل المثال، تمتد) والسياق المرضي (على سبيل المثال، نقص التروية). هذه المنهجية لها العديد من المزايا مثل اشتراط الحد الأدنى من عضلة القلب لتقييم وظيفة في عضلة القلب التي تم الحصول عليها من عينات المذابة; باستخدام cardiomyocytes من مجموعة واسعة من الأنواع (الفئران13، الفئران1،14،15، الأرنب16، خنزير17، الكلب18، خنزير غينيا19 والإنسان20) ومواقع مختلفة القلب ، بما في ذلك الأذين ، والبطينين الأيسر والأيّن أو منطقة معينة من القلب المهاد. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه التقنية بتقديم تركيزات محددة من Ca2+ والطاقة (ATP) مع قياس وظيفة الهياكل التنظيمية والانكماشية في تكوينها الأصلي.
على الرغم من بساطة هذه التقنية ، هناك بعض الخطوات الحاسمة. من الضروري ضمان جودة كل خطوة من البداية، بما في ذلك جمع العينات. Myofilament البروتينات عرضة للبروتيازات21. وبالتالي فإنه من الضروري تخزين العينات في النيتروجين السائل مباشرة بعد جمعها. وسوف تطور العينات الجديدة، التي لم تكن مجمدة من قبل، قوى أعلى بكثير، لذلك ليس من المستحسن خلط القياسات التي تتم في عينات جديدة ومجمدة في نفس البروتوكول. الخطوة الثانية الأكثر أهمية هي استخراج القلبية أوسميس. خلال هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على العينة على الجليد معظم الوقت. ويمكن استخدام كوكتيل مثبطات البروتياز للحد من خطر تدهور البروتين خلال استخراج / permeabilization22. ثالثا، ينبغي قطع العينات في قطع أصغر باستخدام حركات مشرط دقيقة منذ لاحظنا انخفاض نوعية cardiomyocytes عندما تم تجاهل هذه الخطوة. آخر خطوة حرجة غسل القلبية حيث أنه من الصعب أن يكون التوازن الصحيح بين غسل خارج تريتون (permeabilizes الخلية ولكن يعزز من ungluing) والحفاظ على أكبر عدد ممكن من الخلايا في supernatant ممكن. من المهم أولاً أن نحاول استخراج وعدد الاغتسال لكل عينة أو أنواع أو بروتوكول. على سبيل المثال، في أيدينا، لاحظنا أن استخراج أنسجة الفئران البدناء ZSF1 له جانب “دهنية”، مما جعل هذه الخلايا أكثر زلقًا أثناء الإلتصاق ولكن ليس من الصعب قياسه. الطريقة التي نتحايل على هذه المشكلة كانت عن طريق إجراء المزيد من التجارب أن يكون عدد معقول من الخلايا لكل. وعلاوة على ذلك، فمن الأهمية بمكان لتحديد خلية جيدة الغراء، أي مع التصدع جيدة وطول معقول. إذا لم يكن لديك cardiomyocyte هذه الميزات، فإنه سيتم فصل في الغالب من نصائح إبرة أو تطوير قوة لا / منخفضة. من المهم أيضا استخدام الغراء الصحيح للالمرفق cardiomyocyte، معتبرا الوقت من الالتصاق وفعاليتها للصق الخلية إلى الإبرة. في أيدينا، واللصق سيليكون (جدول المواد)يشفي بسرعة (10-15 دقيقة) وقوية بما فيه الكفاية. وأخيراً، ترتبط الخطوة الحرجة الأخيرة برفع القلب بعناية 5 دقائق بعد الإلتصاق بالخلية (لتجنب الالتصاق بالخلية إلى الأغطية) وقبل نقلها إلى الآبار (لتجنب سحب الخلية من مرحلة المجهر). يلخص الجدول 7 استكشاف الأخطاء وإصلاحها المرتبطة بهذه التقنية، والأسباب الكامنة والحلول الممكنة للتغلب على المشاكل المتكررة.
القيد الرئيسي لهذا الأسلوب هو أنه لا يمكن الإجابة على كافة الأسئلة المتعلقة بالتقلص myofilament، مثل سرعة myofilaments تنشيط /إلغاء تنشيط. في وضع في الجسم الحي، والغشاء إزالة القطبية، وفيما بين الخلايا كاليفورنيا2 + زيادة وانتشاره إلى myofilaments تحتاج إلى أن تحدث لmyocytes إلى العقد، في حين في cardiomyocytes2+ الجلد انتشار إلى myofilaments يحدث على الفور عندما يتم غمر الخلية في الحل كاليفورنيا2+ . هذا معدل أسرع من كاليفورنيا2 + نشر سوف التحيز myofilaments تنشيط / تعطيل تحليل23.
وتتأثر هذه التجارب من قبل عوامل مختلفة، بما في ذلك درجة الحرارة، حل درجة الحرارة، والانزعاج الميكانيكي (الركود إعادة تمتد مقابل الركود) وإجراءات مرفق الخلية (دبوس التعادل مقابل الغراء)، كل هذه المتغيرات المحاسبة لتناقضات الأدب من حيث KTR وزيادة طول الساركومير تعتمد في قوة4،12.
التقدم المستقبلي لهذه التقنية يشمل إجراء دراسات وظيفية في أمراض القلب سليمة بدلا من نفاذها. هذه التقنية لديها عيب الاعتماد على cardiomyocytes معزولة حديثا (لم يتم تجميدها سابقا). وثمة مسألة هامة أخرى لا تتصل مباشرة بهذه المنهجية ولكنها قد تؤثر تأثيراً كبيراً على هذه المنهجية، وهي تتعلق بالفترة القصوى من التخزين المجمد للعينات. على وجه التحديد، من الضروري تحديد درجة تدهور myofilament طوال وقت التخزين (أي، لمدى الوقت الذي يمكن تخزين العينات المجمدة من أجل ضمان بيانات وظيفية ذات نوعية جيدة المستمدة من الخلايا القلبية المستخرجة).
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون المؤسسة البرتغالية للعلوم والتكنولوجيا (FCT) والاتحاد الأوروبي و Quadro de referência Estratégico Nacional (QREN) و Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) و Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPET) لتمويل وحدة البحث UnIC (UID/IC/00051/2013). هذا المشروع مدعوم من قبل فيدر من خلال COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI)، ومشروع DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003)، بدعم من برنامج التشغيل الإقليمي نورتي البرتغال (NORTE 2020)، بموجب اتفاقية الشراكة البرتغال 2020، من خلال الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (ERDF)، ومشروع NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385)، بدعم من الصناديق الهيكلية والاستثمارية الأوروبية، برنامج لشبونة التشغيلي الإقليمي 2020. تم تمويل باتريا رودريغز من قبل FCT (SFRH/BD/96026/2013) وكان جواو ألميدا كويلو من قبل جامعة دو بورتو / FMUP و FSE -Fundo الاجتماعية Europeu ، NORTE 2020-Programa Operacional الإقليمية تفعل نورتي، (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Acetone | Sigma | 34580 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
Imidazole | VWR | 24720.157 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
Length Controller ( Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
Inverted Microscope (IX51) | Olympus |