هذا في الوقت الحقيقي RT-PCR باستخدام صبغ dsDNA intercalating هو مناسبة لتشخيص التهابات فيروس ليسا. تبدأ الطريقة مع الحمض النووي الريبي المستخرج من داء الكلب المشتبه به قبل الوفاة أو عينات ما بعد الوفاة، بالتفصيل إعداد المزيج الرئيسي، إضافة RNA، وإعداد الجهاز في الوقت الحقيقي والتفسير الصحيح للنتائج.
الاختبارات الجزيئية سريعة وحساسة ومحددة، وأصبحت مركزية لتشخيص داء الكلب. وقد استخدمت الاختبارات المستندة إلى PCR لعقود لتأكيد تشخيص داء الكلب ولكن لم تقبلها المنظمة العالمية لصحة الحيوان إلا مؤخراً كطريقة أولية للكشف عن عدوى داء الكلب. توفر عمليات اختبار RT-PCR في الوقت الحقيقي بيانات في الوقت الحقيقي، وهي أنظمة أنابيب مغلقة، مما يقلل من خطر التلوث أثناء الإعداد. لا تتطلب اختبارات RT-PCR المتداخلة مع الحمض النووي الفلوروكروم في الوقت الحقيقي تحقيقات مكلفة، مما يقلل من تكلفة العينة الواحدة، وعندما يتم تصميم المواد التمهيدية في المناطق المحفوظة، فإن الاختبارات المحددة عبر أجناس الفيروس بدلاً من التحديد لفيروس واحد فقط الأنواع ممكنة. هنا نقوم بوصف جهاز الـ “آر تي-بي آر” في الوقت الحقيقي الذي يكشف فيروسات الليسا في جميع أنحاء جنس ليسافيروس، بما في ذلك الفيروسات الأكثر تبايناً IKOV وWCBV وLLEBV. وبالاقتران مع تحليل منحنى التفكك، فإن هذا الاختبار حساس ومحدد، مع ميزة الكشف عن جميع أنواع فيروس الليسا. وقد تم اعتماد الفحص في العديد من مختبرات التشخيص مع بيئات مضمونة الجودة، مما يتيح تشخيص قوي وسريع وحساس لحالات داء الكلب الحيواني والبشري.
وقد قبلت منظمة الطاقة العالمية تشخيص داء الكلبباستخدام المنهجيات الجزيئية في عام 2018 1، مع الاعتراف بمزايا هذه التقنيات في تأكيد حالات داء الكلب، لا سيما في الحالات التي تكون فيها العينات دون المستوى الأمثل، أو لتشخيص ما قبل الوفاة، كما لا يوجد شرط للفيروس الحية أو عينات جديدة. تتطلب عمليات فحص PCR للفيروسات الليسافية نسخًا عكسيًا (RT) قبل أن يبدأ PCR لأن الجينوم هو الحمض النووي الريبي. تعتبر الاختبارات RT-PCR التي تكشف عن المنطقة القريبة من 3′ من الجينوم الأكثر حساسية، كما تحدث التدرجات النسخي أثناء النسخ المتماثل فيروس lyssa. يمكن تقسيم الاختبارات RT-PCR الشائعة الاستخدام بشكل عام إلى فئتين، نقطة النهاية (أو المستندة إلى هلام) وفي الوقت الحقيقي. وكلا النهجين حساس انما محدد؛ ومع ذلك، فإن الاختبار في الوقت الحقيقي له بعض الفوائد الإضافية مثل الحصول على نتائج في “الوقت الحقيقي” ويجري تنفيذها في نظام أنبوب مغلق تماما، وبالتالي الحد من احتمال تلوث المشغل. هناك نهجان رئيسيان للكشف عن التضخيمات الخاصة بفيروس ليسا التي تم الحصول عليها باستخدام الاختبارات في الوقت الحقيقي. الأولى تستخدم تحقيقات التحلل المائي (مثل تحقيقات تقوى) التي تحتوي على فلوروفور وquencher. وعندما يرتبط المسبار بالمنطقة المستهدفة أثناء التضخيم، يؤدي نشاط الإثارة للبوليميراز إلى تفكك الفلوروفور وعصارة الفلور، مما يمكّن من قياس الفلورة الناتجة عن ذلك. والثاني يستخدم صبغة الحمض النووي المتداخلة (فلوروكروم مثل SYBR الأخضر) التي تربط لمضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل أثناء التضخيم. تنبعث من الفلوروكرومات المقيدة الفلورة التي يتم الكشف عنها في كل دورة، مما يسمح بالكشف في الوقت الحقيقي والقياس الكمي للمنتج. نظرا ً للطبيعة غير المحددة للربط بأي dsDNA، يتم إجراء تحليل منحنى التفكك لتأكيد خصوصية رد الفعل. وتكون الـ RT-PCRs في الوقت الحقيقي سريعة بسبب أحجام الاملييكون الصغيرة، التي يقل طولها عادة عن 200 نقطة أساس؛ ومع ذلك، فإن تحديد المناطق المناسبة لتصميم المواد التمهيدية وتحقيقات في المناطق المحفوظة، يمكن أن يثبت تحديا، وبالتالي إزالة شرط التحقيق هو ميزة متميزة.
وقد تم تصميم عدد من الـ RT-PCRs في الوقت الحقيقي للكشف على وجه التحديد عن سلالات فردية أو سلالات من RABV2 وأيضا للكشف عن الفيروسات الليسا في جميع أنحاء جنس3،4،5،6، 7،8،9. جميع الاختبارات سيكون لها حد من الكشف تعتمد على كيفية الحفاظ على التمهيدي (وإذا لزم الأمر، والمسبار) تسلسل هي عبر جنس. والواقع أن سلالات الفيروس الناشئة أو الجديدة قد تجعل الاختبارات المحددة للغاية القائمة على المسبار غير فعالة. اختيار الكشف في الوقت الحقيقي (صبغ مقابل التحقيق) سوف تعتمد على التطبيق المقصود. بالنسبة لمختبر يقوم بمراقبة مواد الدماغ من مصادر محلية ويتوقع أعداد كبيرة من العينات السلبية، فإن استخدام الصبغة المتداخلة الأرخص هو خيار معقول. كما أن النهج الأخضر SYBR سيكون الأمثل عند إجراء مراقبة المسح الضوئي حيث لا يزال وجود فيروسات ليسا جديدة أو متباينة دون الكشف عنها من خلال اختبارات أكثر تقييدا المستندة إلى التحقيق.
جميع أعضاء جنس Lyssaفيروس يسبب مرض داء الكلب، الذي هو قاتل ة بمجرد ظهور الأعراض. الغالبية العظمى من حالات داء الكلب البشري والحيواني بسبب فيروس داء الكلب (RABV)، الخزان المهيمن الذي هو الكلب المنزلي10. الخفافيش هي الخزانات المضيفة الهامة للفيروسات الليسافيروس وجميع ما عدا اثنين من أنواع فيروس ليسا تتميز تم التعرف عليها مباشرة في الخفافيش — إيكوما ليسافيروس (IKOV) وفيروس موكولا (MOKV) – ومن هذين، وقد تم التكهن IKOV أن يكون خزان المضيف الخفافيش 11.بالإضافة إلى 16 الأنواع المعترف بها lyssavirus12, هناك اثنين من الفيروسات lyssaالتي تم وصفها مؤخرا: تايوان الخفافيش lyssavirus (TWBLV)13 وKotalahti الخفافيش lyssavirus (KBLV)14. يمكن تقسيم فيروسات الليسا وراثيا إلى ثلاث مجموعات فيلو، مع غالبية الفيروسات الليسافية، بما في ذلك RABV، تنتمي إلى مجموعة فيلوجروب 1. ومع ذلك، فإن فيروسات الليسا الأكثر تبايناً تنتمي إلى المجموعة الثالثة من الليسوجروب، ومن غير المرجح أن يتم اكتشافها بواسطة RT-PCRs المصممة لاستهداف تسلسلات فيروس RABV أو phylogroup I.
يستخدم الوصف الموضح هنا زوج التمهيدي في الوقت الحقيقي JW12-N165، الذي تم وصفه لأول مرة في عام 20053. تم تصميم المواد التمهيدية لتكون فيروس pan-lyssaعلى الرغم من أن التطبيق الأصلي كان بمثابة إجراء تحقيق من قبل شركة TaqMan مع تحقيقات للتمييز بين أنواع فيروس ليسا. تم تحقيق تأكيد لاحق أن الزوج التمهيدي كان pan-lyssavirus في خصوصية باستخدام اختبار SYBR 2-الخطوة في الوقت الحقيقي على جميع أنواع فيروس lyssa المتاحة بما في ذلك WCBV15. ويرد وصف الزوج التمهيدي هنا في اختبار RT-PCR من خطوة واحدة في الوقت الحقيقي باستخدام الفلوروكروم intercalating، والتحقق من صحة باستخدام ممثلين من جميع الأنواع 16 فيروس lyssa المعترف بها. هذا التقييم في الوقت الحقيقي خطوة واحدة هو سريع, حساسة, اختبار فيروس ليسا محددة ويدل على أن قوة التمهيدي مجموعة لتحديد حتى الأنواع فيروس ليسا متباينة للغاية.
ال [بن-ليسفيروس] [رل-ر] [ر]-[ر] وصف إنقوسة [أن-بوب], [أن-ستب] إنقوس اتّصال أيّ يكشف [ليسفيروسس] عبر كلّ ثلاثة [فولوغوغر]. وقد تم التحقق من صحة الفحص لتشخيص داء الكلب الحيواني والبشري على حد سواء، بما في ذلك أنسجة الدماغ بعد الوفاة (جذع الدماغ الأمثل)، وعينات ما قبل الوفاة مثل خزعة الجلد، اللعاب الذي تم جمعه بشكل تسلسلي، أو السائل الشوكي الدماغي (CSF). وقد تم تصميم المواد التمهيدية المستخدمة في هذا الفحص واستخدامها لأول مرة في اختبار قائم على التحقيق للتمييز بين RABV وEBLV-1 وEBLV-23، والتي استخدمت في العديد من مختبرات داء الكلب OIE وينفذ باستمرار في خطط الكفاءة EURL. في وقت لاحق تم تأكيد طبيعة ‘pan-lyssavirus’ من هذه المواد التمهيدية باستخدام 2 خطوة في الوقت الحقيقي —15. وقد استخدم الاختبار الموصوف هنا المواد التمهيدية لزيادة تحسين RT-PCR في اختبار SYBR خطوة واحدة مما يتيح نظام مغلق ووسريع. وعلاوة على ذلك، أكد التدريب في البلدان الموبوءة بداء الكلب باستخدام هذا الفحص ملاءمة التنفيذ في أي مختبر مع معدات الوقاية الشخصية الأساسية ونظم الجودة للحد من التلوث المتبادل وعينات التتبع، ومرافق لتخزين الكواشف وفي الوقت الحقيقي آلة مع الكشف عن SYBR. فحص قوي للغاية ولها علاقة 100٪ مع FAT، معحساسية محسنة للعينات المتحللة 3. واحدة من المزايا الرئيسية لصبغة الحمض النووي intercalating على أساس اختبار بالمقارنة مع التحقيق على أساس الاختبار هو التكلفة النسبية. وهناك فائدة إضافية هي أن التبيّد لا يستخدم سوى اثنين من المواد التمهيدية، وبالتالي فإن خطر فشل الكشف بسبب الاختلاف في التسلسل، والذي كان نقطة ضعف في الاختبارات المستندة إلى التحقيق التي سبق نشرها. في الواقع، يتم الكشف عن ممثلي جميع أنواع فيروس lyssa (وبصرف النظر عن TWBLV وKBLV) باستخدام هذا التحليل، وتحليل تسلسل TWBLV وKBLV عبر المواقع التمهيدية يكشف عن أي اختلاف كبير مما يوحي بقوة أنه سيتم الكشف عنها أيضا باستخدام هذه الطريقة. نطاق الحد من الكشف لوحظ عبر الفيروسات التي تم تحليلها، يمكن اعتبار أن يكون بسبب عاملين رئيسيين. الأول هو أن الحمض النووي الريبي كان معزولا عن مواد الدماغ السريرية، وبالتالي فإن كمية نسخ الجينوم في كل عينة غير مخففة ليست قابلة للمقارنة مباشرة. تم “تطبيع” الحمض النووي الريبي عن طريق تعديل إجمالي الحمض النووي الريبي إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر. ومع ذلك، فإن نسبة الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي داخل تلك العينة سوف تختلف. والثاني هو تنوع تسلسل فيروس الليسا، على الرغم من أن المواقع التمهيدية تقع في المناطق المحفوظة، لا تزال هناك مواقف من الاختلاف. لذلك، فإنه ليس من المستغرب أن غالبية الفيروسات lyssaمع حساسية أقل للاستطلاع هي الفيروسات phylogroup II و III. ويمثل تحليل منحنى التفكك معلمة أساسية، مما يقلل إلى أدنى حد من النتيجة الإيجابية الزائفة التي يمكن أن تحدث لولا ذلك بسبب تشكيل أجهزة التديم التمهيدية، أو تضخيم منطقة غير محددة في الجينوم المضيف. في الواقع، وهذا هو حدث نادر وتحليل منحنى التفكك يعادل تشغيل هلام أغاروز لتصور الحجم الصحيح التقليدية RT-PCR amplicons. تم توفير مجموعة من القيم TM المقبولة (77-80 درجة مئوية)، استنادا ً إلى البيانات التي تم جمعها في مختبرنا. ويوصى بشدة بأن تقوم فرادى المختبرات بتجميع البيانات الداخلية لضمان نقل النطاق وتعديله وفقا لذلك. إن تفسير النتائج من كل من قطع التضخيم والتفكك، إلى جانب الضوابط الإيجابية والسلبية ونتائج الأكتين، يمكّن من تحقيق نتائج تشخيصية قوية وقابلة للاستنساخ.
خارج نطاق هذا البروتوكول هو طريقة استخراج RNA المستخدمة للحصول على الحمض النووي الريبي عالية الجودة. تم إعداد جميع الحمض النووي الريبي تحليلها في هذا البروتوكول باستخدام TRIzol; ومع ذلك، هناك العديد من البروتوكولات مناسبة استخراج الحمض النووي الريبي القائم على guanidium المتاحة، بما في ذلك العمود ومجموعات استخراج على أساس حبة. ويجب أن يكون التعامل مع عينات فيروس الليسا الإيجابية (أو المشتبه فيها إيجابية) داخل مرافق الاحتواء البيولوجي المرخص لها المعتمدة داخل البلد. ومع ذلك، فإن مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج غير معدي، وبالتالي يتم التعامل معه داخل مختبرات الاحتواء المنخفض. واعتمادا على طريقة الاستخراج المستخدمة، سيلزم تقييم شرط التحديد الكمي للRNA والتخفيف منه. وبالنسبة للاستخراج القائم على الفينول، بما في ذلك TRIzol، فإن هذه الخطوة مطلوبة وتمنع تثبيط الاختبار من تلويث الجدنا؛ ومع ذلك، فإن الاستخراج القائم على العمود والخرز (لا سيما تلك التي تعاني من مرحلة استنفاد الحمض النووي) لا تتطلب التخفيف قبل الاختبار.
وفي جميع أجزاء البروتوكول، من الضروري استخدام الرعاية والعناية لمنع التلوث المتبادل والإضافة الدقيقة للعينة إلى الآبار الصحيحة. يتوفر جدول بيانات مع حسابات الكاشف وتخطيط اللوحة للتنزيل كملف تكميلي. الممارسات المختبرية الجيدة، بما في ذلك أسطح العمل النظيفة، والتغيرات المنتظمة في القفازات، واستخدام نصائح الحاجز وغرف مختلفة / خزانات الأشعة فوق البنفسجية لفصل كل مرحلة سوف تقلل من فرصة التلوث. للتأكد من تنفيذ الاختبار مع المعلمات المتوقعة، يجب تضمين عناصر التحكم الإيجابية والسلبية وتشغيل كافة نماذج الاختبار في تكرار (أو ثلاثية).
إدراج الضوابط هو سمة أساسية من سمات أي PCR، وخاصة بالنسبة للتشخيص. تم إعداد الحمض النووي الريبي التحكم الإيجابي من CVS (معيار فيروس التحدي) العقول الماوس المصابة على دفعات والتحقق من صحتها ومعايرة لضمان الاتساق بين دفعات. تم تحديد الحمض النووي الريبي للتحكم كمياً وتم تخفيفه إلى 1 ميكروغرام/ميكرولتر. تم تخزين الحمض النووي الريبي التحكم الإيجابي في -80 درجة مئوية في 10-1 aliquots. وعند الاقتضاء، تم تخفيف العليكوت 1:100 لتوفير مخزون عامل عند 1 نانوغرام/ميكرولتر وتخزينه عند -80 درجة مئوية في 5 ميكروات من العليكوتات ذات الاستخدام الواحد. تم استخدام الحمض النووي الريبي للتحكم الإيجابي المخفف لتمثيل عينات إيجابية منخفضة المستوى، ولضمان الكشف عن أي انخفاض في حساسية الفحص. تم الاحتفاظ بـ “بطاقة تحكم” لكل عنصر تحكم لمراقبة قيمC t وتحديد الاتجاهات (الجدول5). ويبين الجدول 5 قابلية جيدة للمقارنة بين الدورات بالنسبة لعينات التحكم الإيجابية في نظام CVS Ct and Tm القيم عبر عدة أيام والمشغلين، مما يوفر الطمأنينة بأن التبيّد قوي وقابل للاستنساخ. وينبغي التحقيق في النتائج التي تحيد عن هذه القياسات وتكرار عينات الاختبار إذا لزم الأمر. تم تضمين المياه الصف الجزيئي في كل تشغيل كالمجلس الوطني الانتقالي للتأكد من الكواشف كانت خالية من التلوث مع الحمض النووي الريبي lyssavirus وتأكيد عينة سلبية. وعلاوة على ذلك، لضمان فعالية استخراج الحمض النووي الريبي، تم اختبار ß-actin جنبا إلى جنب مع عينات الاختبار في أنبوب منفصل. كما تم استخدام الحمض النووي الريبي للتحكم الإيجابي في lyssavirus للتحكم الإيجابي في الأكتين. ويمكن استخدام جينات محلية أخرى أو نظم تحكم داخلي غير متجانسة. تضمن استخدام عناصر التحكم هذه تحليل كافة الخطوات بنفس شروط نماذج الاختبار. في بعض الأحيان، إذا كانت العينة متدهورة للغاية أو لم تحتوي على ما يكفي من الحمض النووي الريبي المضيف (مثل اللعاب أو CSF)، يمكن أن تفشل PCR الجينات الذاتية. في هذه الحالة، حيث كانت نتيجة LYssavirus في الوقت الحقيقي RT-PCR إيجابية، تأكيد على استخراج الحمض النووي الريبي مستقلة – لاستبعاد التلوث أثناء استخراج الحمض النووي الريبي على الاختبار الأصلي أو عن طريق اختبار ثانوي (إما الجزيئية، مثل التقليدية RT-PCR) ، أو FAT. وقد كفل استخدام الجدول 4 أثناء تحليل عينة تشخيصية التفسير الصحيح.
بغض النظر عن الاختبار الجزيئي المستخدم لتأكيد عدوى داء الكلب، ينبغي أيضاً إجراء متابعة التحقيقات باستخدام تسلسل Sanger لتحديد أنواع فيروس ليسا والتقنيات الكلاسيكية في علم الفيروسات مثل FAT أو عزل الفيروس للسماح مزيد من توصيف الفيروس ودعم الإخطار بالحالات الإيجابية إلى منظمة الصحة العالمية ومنظمة الصحة العالمية.
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفان أن يشكرا الآنسة إيما وايز والآنسة ميغان غولدينغ على مساعدتهما في إنجاز التجارب. وقد تلقى تطوير هذا البروتوكول دعما ماليا من وزارة البيئة والأغذية والشؤون الريفية في المملكة المتحدة والحكومة الاسكتلندية والحكومة الويلزية من خلال المنح [SV3500 وSE0431] ومشروع “الأرشيف العالمي للفيروسات الأوروبية” (EVAg) الذي تلقى تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاقية المنح رقم 653316.
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |