A invasão perineural é um phenotype agressivo para carcinomas de pilha Squamous da cabeça e da garganta e outros tumores. O modelo de membrana corioalantoica de pintinho tem sido usado para estudar angiogênese, invasão de câncer e metástase. Aqui nós demonstramos como este modelo pode ser utilizado para avaliar a invasão perineural in vivo.
A invasão perineural é um phenotype em que o cancro circunda ou invade os nervos. É associado com o resultado clínico pobre para a carcinoma de pilha Squamous da cabeça e da garganta e os outros cancros. Estudos mecanísticos mostraram que a conversa cruzada molecular entre nervos e células tumorais ocorre antes da interação física. Há somente alguns modelos in vivo para estudar a invasão perineural, especialmente para investigar a progressão adiantada, antes que as interações físicas do nervo-tumor ocorram. O modelo de membrana corioalantoica do pintinho tem sido usado para estudar a invasão do câncer, pois a membrana basal do epitélio coriônico imita a do tecido epitelial humano. Aqui nós reaproveitado o modelo da membrana do chorioalantoic do pintainho para investigar a invasão perineural, o gânglio dorsal da raiz do rato da transplantação e a cabeça humana e as pilhas de carcinoma de pilha Squamous da garganta no epitélio coriónico. Demonstramos como esse modelo pode ser útil para avaliar a capacidade das células cancerosas de invadir o tecido neural in vivo.
A invasão perineural (PNI) é um fenótipo subestudado no câncer, que está associado com alta recorrência da doença e baixa sobrevida em pacientes com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNC)1. PNI é definido microscopicamente como pilhas do tumor dentro ou que cercam os nervos2,3. Quando a PNI é detectada, é provável que os pacientes recebam terapias adjuvantes, como dissecção de pescoço eletiva e/ou radioterapia4,5. No entanto, essas terapias são agressivas e não específicas de PNI. Na verdade, não há terapia para bloquear a PNI, principalmente porque os mecanismos subjacentes às interações nervo-tumor ainda são pouco compreendidos.
Os mecanismos moleculars diferentes foram implicados na atração do nervo-tumor; tumores e células estromais liberam neuropeptídeos e fatores de crescimento para promover a neuritogênese6,7. Quando cultivadas juntas in vitro, as células HNC e os gânglios da raiz dorsal (DRG) têm uma resposta robusta; efeitos na invasão de células tumorais e neuritogênese podem ser observados após alguns dias nacultura 6,8,9. Entretanto, há uma falta de modelos in vivo apropriados para recapitular interações tumor-nervosas antes da invasão. Aqui nós apresentamos um modelo in vivo de PNI para estudar interações precoces entre células HNC e nervos6. Nós adaptamos o modelo da membrana corioalantoica do pintainho (CAM) para incluir um componente neural, transplantar um DRG no CAM, seguido por um enxerto de células cancerosas para imitar um microambiente inervado do tumor.
O modelo CAM tem sido utilizado com sucesso para avaliar a invasão de células através da membrana basal, imitando estágios invasivos precoces de carcinomas e melanoma10,11,12. O CAM é compreendido do epitélio coriónico superior, do mesenchyme de intervenção, e do epitélio alantoic mais baixo. O epitélio coriônico é estruturalmente semelhante ao epitélio humano10,13 em que a membrana basal colágeno-IV-rica simula a membrana basal que separa o epitélio oral do tecido conjuntivo subjacente. Desde que os primeiros enxertos tumorais foram realizados no Cam em 191314, muitas adaptações do método foram desenvolvidas para permitir a avaliação da angiogênese15,16,17, progressão tumoral e metástase18. Importante, a técnica de enxertia tumores no CAM mudou muito pouco, mas as aplicações estão evoluindo continuamente. Foram publicados ensaios de complexidade crescente, incluindo a triagem de medicamentos19, engenharia de tecidos ósseos20e medicamentos anticâncer baseados em nanopartículas21.
Nosso laboratório usa um modelo CAM-DRG no qual um DRG de mamíferos é isolado e enxertado na superfície do CAM superior. Depois que o DRG se torna incorporado no CAM, as pilhas de HNC são enxertadas perto do DRG e permitidas interagir com o DRG antes que o sistema in vivo inteiro esteja colhido e analisado. Importante, o sistema permite a observação visual ex-vivo do DRG e do tumor pela rotulagem da fluorescência de DRG e de pilhas do tumor. Este protocolo compreende múltiplos passos com diferentes níveis de complexidade realizados no prazo de 17 dias, desde a incubação dos ovos até a colheita do CAM (Figura 1). Células que expressam diferentes proteínas de interesse podem ser testadas neste modelo para elucidar as vias moleculares responsáveis pela invasão nervosa no câncer, e também para a triagem de drogas para direcionar diretamente a invasão neural. As células pré-tratadas com um fármaco candidato podem ser enxertadas no CAM e a ocorrência de PNI investigada em comparação com os controles não tratados. De fato, o modelo CAM tem sido utilizado para triagem de fármacos como um passo intermediário entre estudos in vitro e ensaios pré-clínicos in vivo em roedores19.
O delineamento experimental variará com a hipótese. Por exemplo, se testando o papel de uma proteína específica em PNI, o grupo experimental incluiria DRG enxertado com as pilhas do tumor que superexpressam a proteína, quando o grupo de controle deve incluir DRG com as pilhas transfected estàvel com vetor vazio. Diversos projetos experimentais diferentes podem ser usados para endereçar perguntas específicas.
O modelo de CAM-DRG in vivo apresentado aqui aborda os déficits de modelos anteriores demonstrando interação nervo-tumor antes da invasão física do nervo por células tumorais. A maioria de estudos in vivo do foco de PNI na propagação e na inibição do tumor da função de motor, e dependem em cima da injeção direta de pilhas do tumor em nervos ciático23,24,25. A injeção do nervo ciático é um in vivo modelo de PNI onde as pilhas cancerosas são injetadas em um rato ou em um nervo ciático do rato onde o tumor cresça subseqüentemente. Modelos de injeção são úteis para mostrar a progressão do tumor destrutivo e dor resultante de células tumorais dentro dos nervos. O modelo do nervo ciático é igualmente apropriado para o estudo dos fatores que permitem que as pilhas de cancro prosperem no nervo mas não faltam a habilidade de avaliar a fase adiantada de PNI, porque introduz pilhas diretamente no nervo, ignorando bainhas do nervo. Em uma aproximação diferente, os enxertos transplantação orthotopic do cirùrgica implantados do tumor foram usados para caracterizar a importância de fibras de nervo adrenérgicos e colinérgicos em promover a progressão do cancro da próstata, assim sugerindo um papel proeminente dos nervos na progressão do tumor o modelo 26. this consistiu na ablação química de nervos simpáticos e parassimpáticos murino. As fibras parassimpáticas infiltraram tecidos tumorais, um processo relacionado à PNI, mas o modelo não foi especificamente utilizado para avaliar as interações físicas entre o nervo e o tumor. O modelo CAM-DRG permite a investigação de interações entre o nervo e o câncer durante a PNI. Além disso, os modelos murinos são dispendiosos e demorados quando comparados com o modelo CAM. Sugerimos o uso do modelo CAM-DRG para estudos mecanísticos de PNI.
Algumas vantagens para a abordagem CAM-DRG incluem a avaliação de PNI e outros fenótipos, como crescimento tumoral, metástase e angiogênese. A identificação do ADN humano no CAM mais baixo e/ou no fígado pode ser usada para a deteção da metástase de linhas de célula cancerosas humanas10, uma aproximação experimental mais sensível comparada ao seccionamento e à mancha do tecido, que não podem revelar metástases pequenas.
O método CAM-DRG tem algumas limitações, incluindo o curto período de tempo de observação. O sistema imunológico do embrião é fisiologicamente ativo no dia 1827, quando a rejeição e um processo inflamatório podem ocorrer, limitando o tempo experimental. É igualmente importante considerar a distância ao transplantar pilhas do tumor perto do DRG; as distâncias maiores do DRG-Cancer puderam prejudicar as interações moleculars entre pilhas e nervo do tumor, ou poderiam retardar o contato físico entre ambos os componentes do modelo. Também, se os embriões são mais velhos do que estipulado neste protocolo, os movimentos do embrião puderam deslocar as pilhas do tumor. Portanto, é importante usar ovos consistentes com o dia 10 pós-fertilização para enxerto celular.
Desde que o sistema imunitário não é desenvolvido inteiramente antes do dia 1827, o microambiente do tumor no Cam é similar àquele dos modelos murino immunosuprimidos usados frequentemente para estudos do cancro. Portanto, este modelo não é útil para avaliar o papel das células imunes na progressão tumoral. Outra limitação é a disponibilidade restrita de reagentes para espécies de frango, como anticorpos, citocinas e primers.
Executar com precisão este protocolo requer prática; Entretanto, pode ser feito por um membro do laboratório sem necessidade para uma facilidade especializada do núcleo. A perfuração do escudo do ovo exige o treinamento. Praticar em ovos de mercearia (não fertilizados) é recomendado antes de tentar este modelo pela primeira vez. A sobrevivência embrionária elevada e o sucesso do modelo podem ser conseguidos se algumas etapas críticas para evitar a infecção forem seguidas: profilaxia antibiótica apropriada de DRGs em 2% Pen/strep, trabalhando em um armário do fluxo laminar, e evitando a dispersão de partículas do escudo de ovo para o CAM. É igualmente crucial manter a umidade estável durante o tempo total da incubação do ovo. Recomendamos aumentar o número de ovos por grupo até que a técnica seja dominada. Os problemas os mais freqüentes para o pessoal inexperiente do laboratório são contaminação do ovo e técnica imprecisa para a transplantação da pilha.
A colheita de DRG também requer treinamento; prática na colheita de DRGs para experimentos in vitro8 antes de tentar o modelo in vivo é recomendado. A cultura DRG in vitro é uma oportunidade para otimizar as condições e melhorar a técnica para encurtar a duração da extração de DRG. Atenção especial para a técnica de colheita é necessária quando agarrando o DRG com fórceps. O DRG não deve ser mantido diretamente; pressão deve ser aplicada por baixo. Recomendamos o uso de lente de ampliação para visualizar melhor o DRG durante a extração.
Importante, ao executar este modelo pela primeira vez, todas as condições devem ser otimizadas para a linha celular desejada. Este modelo foi otimizado para DRG de ratos e a linha de células HNC UM-SCC-1. O uso de mouse DRG e outros tipos de células cancerosas pode exigir otimização. Com uma concentração mais elevada de pilhas enxertadas, os tumores tendem a crescer mais grossos e mais duros, que facilita medidas do tumor. Levando em consideração vários ovos para cada grupo e uma concentração adequada de células para cada ovo, vários milhões de células podem ser necessárias para cada experimento. Para facilitar o planeamento, o conhecimento do tempo de duplicação das pilhas deve ser tomado na consideração. Para algumas etapas críticas neste protocolo, uma tabela de solução de problemas é fornecida (tabela 1).
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por concessões NIH/NIDCR DE027551 e DE022567 (NJD).
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |