Perinevral invazyonu baş ve boyun skuanöz hücre karsinomları ve diğer tümörlerde agresif bir fenotiptir. Piliç chorioallantoik membran modeli anjiyogenez, kanser istilası ve metastif eğitimi için kullanılmıştır. Burada bu modelin perineval invazyonu in vivo olarak değerlendirmek için nasıl kullanılabilirler olduğunu gösteriyoruz.
Perinevral invazyonu kanser çevreleyen veya sinirleri istila bir fenotip olduğunu. Baş ve boyun skuayöz Hücre Karsinomu ve diğer kanserler için kötü klinik sonuçlar ile ilişkilidir. Mekanik çalışmalar, sinirler ve tümör hücreleri arasındaki moleküler çapraz fiziksel etkileşimden önce oluştuğunu göstermiştir. Perinevral invazyonu incelemek için, özellikle fiziksel sinir-tümör etkileşimleri oluşmadan önce erken ilerlemeyi araştırmak için sadece birkaç in vivo model vardır. Piliç chorioallantoik membran modeli kanserli invazyonu incelemek için kullanılmıştır, çünkü koronik epitelin Bodrum membranı, insan epitelyal dokusunu taklit eder. Burada, perinevral invazyonu araştırmak için piliç chorioallantoik membran modelini repurposed, sıçan dorsal kök ganglionlar ve insan baş ve boyun skuasöz Hücre Karsinomu hücrelerinde koronik epitelyum üzerine grepleme. Biz nasıl bu model kanser hücrelerinin yeteneği in vivo nöral doku istila yeteneğini değerlendirmek için yararlı olabilir göstermiştir.
Perinevral invazyon (PNı), baş ve boyun skuayöz Hücre Karsinomu (HNC)1olan hastalarda yüksek hastalık nüks ve kötü hayatta kalma ile ilişkili olan kanserde underokudu phenoype olduğunu. Pni mikroskobik olarak tanımlanan veya sinirler çevreleyen tümör hücreleri olarak2,3. Pni algılandığında, hastalar seçmeli boyun diseksiyonu ve/veya radyasyon terapisi gibi adjuvan tedaviler almak muhtemeldir4,5. Ancak, bu tedaviler agresif, ve PNı özgü değil. Aslında, PNı engellemek için hiçbir terapi, öncelikle çünkü sinir-tümör etkileşimleri temel mekanizmaları hala kötü anlaşılmasıdır.
Sinir-tümör cazibe içinde farklı moleküler mekanizmalar karışmıştır; tümör ve stromal hücreler neuritogenesis yükseltmek için nöropeptidler ve büyüme faktörleri serbest6,7. İn vitro ile birlikte kültürlü olduğunda, HNC hücreleri ve dorsal kök ganglionlar (DRG) hem sağlam bir yanıt var; tümör hücre invazyonu ve neuritogenesis üzerindeki etkileri birkaç gün sonra kültür6,8,9görülebilir. Ancak, invazyonu öncesinde tümör-sinir etkileşimlerini tekrar etmek için uygun in vivo modellerde eksikliği vardır. Burada HNC hücreleri ve sinirler arasında erken etkileşimleri incelemek için bir in vivo PNı modeli sunuyoruz6. Biz piliç chorioallantoic membran (CAM) model bir nöral bileşeni dahil etmek için adapte, CAM bir DRG greftleme, kanser hücrelerinin bir greft tarafından takip eden bir iç tümör mikroçevre taklit.
CAM modeli, kanseromlar ve melanom erken invaziv aşamaları taklit, Bodrum membran aracılığıyla hücrelerin istilasını değerlendirmek için başarıyla kullanılmıştır10,11,12. CAM, üst koronik epitelyum, müdahale eden mesenmüme ve düşük allantotik epitelyondan oluşur. Koronik epitelyum, kolajen-IV açısından zengin Bodrum membranının temel bağ dokusundan oral epitelin ayıran Bodrum membranı simüle eden insan epitelyum10,13 ‘ e yapısal olarak benzer. 191314‘ te cam ‘de ilk tümör greftleri gerçekleştirildiği için, anjiyojenik15,16,17, tümör progresyonunun değerlendirilmesine izin vermek üzere yöntemin birçok adaptasyon geliştirilmesi ve metasif18. Daha da önemlisi, CAM üzerine greyleme tümörlerinin tekniği çok az değişti, ancak uygulamalar sürekli gelişmektedir. İlaç taraması19, kemik dokusu Mühendisliği20ve Nanoparticle tabanlı antikanser ilaçları21de dahil olmak üzere, artan karmaşıklık asdaları yayımlandı.
Laboratuvarımız, bir memeli DRG ‘nin üst CAM yüzeyine izole ve grestli olduğu bir CAM-DRG modeli kullanır. DRG CAM ‘e eklendikten sonra, HNC hücreleri DRG ‘nin yakınında erir ve tüm in vivo sistem hasat edildikten ve analiz edildikten önce DRG ile etkileşime girilebilir. Daha da önemlisi, sistem DRG ve tümör hücrelerinin floresans etiketleme ile hem DRG ve tümör ex-vivo görsel gözlem sağlar. Bu protokol 17 gün içinde gerçekleştirilen farklı karmaşıklık düzeylerine sahip birden fazla adımla birlikte yumurta kulkartan CAM hasat etmek için (Şekil 1) oluşmaktadır. Farklı ilgi proteinlerini ifade eden hücreler, kanserde sinir istilasından sorumlu moleküler yollar ve aynı zamanda doğrudan nöral istilayı hedefleyen ilaçların taranması için bu modelde test edilebilir. Bir aday ilaçla önceden tedavi edilen hücreler, CAM üzerinde grepte edilebilir ve tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla PıNI ‘nin oluşumu incelenebilir. Aslında, CAM modeli, uyuşturucu taraması için, in vitro etütler arasında bir ara adım ve kemirgenlerde klinik öncesi in vivo denemeler olarak kullanılmıştır19.
Deneysel tasarım hipotezi ile farklılık gösterecektir. Örneğin, PNI üzerinde belirli bir proteinin rolünü test ederseniz, deneysel grup, proteini aşırı ifade eden tümör hücrelerine sahip DRG ‘yi içerirken, kontrol grubu boş vektörle birlikte stabil transferat edilen hücrelerle DRG içermelidir. Bazı farklı Deneysel tasarımlar belirli soruları ele almak için kullanılabilir.
Burada sunulan CAM-DRG in vivo modeli, tümör hücreleri tarafından sinir fiziksel işgali önce sinir-tümör etkileşimi göstererek önceki modellerin açıkları giderir. Çoğu in vivo çalışmalar PNI odak tümör yayılması ve motor fonksiyonunun inhibisyonu üzerine, ve siyatik sinirler içine tümör hücrelerinin doğrudan enjeksiyon bağlı23,24,25. Siyatik sinir enjeksiyonu, kanser hücrelerinin bir fare veya sıçan Siyatik sinirin içine enjekte edildiği PNı ‘nın bir in vivo modelidir ve tümör daha sonra büyür. Enjeksiyon modelleri sinir içindeki tümör hücrelerinden kaynaklanan yıkıcı tümör ilerlemesini ve ağrıyı göstermek için yararlıdır. Siyatik sinir modeli de kanser hücrelerinin sinir gelişmek için izin faktörler çalışma için uygundur ama PNı erken faz değerlendirmek için yeteneği yoksun, sinir kılıfları bypass, doğrudan sinirin içine hücreleri tanıtır, çünkü. Farklı bir yaklaşımla, prostat kanseri ilerlemesini teşvik eden adrenergik ve kolinerjik sinir liflerinin önemini karakterize etmek için cerrahi olarak implante edilmiş ortootopik tümör greftleri kullanılmıştır, böylece tümör ilerlemesinde sinirlerin önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir 26. bu model, murin sempatik ve parasempatik sinirlerin kimyasal ablasyonu oluşur. Parasempatik lifleri tümör dokularına sızmış, PNı ile ilgili bir süreç, ancak model özellikle sinir ve tümör arasındaki fiziksel etkileşimleri değerlendirmek için kullanılmadı. CAM-DRG modeli PNı sırasında sinir ve kanser arasındaki etkileşimlerin araştırılması sağlar. Ayrıca, duvar modelleri CAM modeline kıyasla pahalı ve zaman alıcı. PNı ‘nın mekanik çalışmaları için CAM-DRG modelini kullanmanızı öneririz.
CAM-DRG yaklaşımının bazı avantajları arasında PNı ve tümör büyümesi, metasrat ve anjiyojenez gibi diğer fenotiplerin değerlendirilmesi yer almaktadır. İnsan DNA ‘sının alt CAM ve/veya karaciğerde tanımlanması, insan kanseri hücre hatlarının metastaz algılanması için kullanılabilir10, doku sekleme ve boyama ile karşılaştırıldığında daha hassas deneysel bir yaklaşım, küçük metasatik ortaya koymayabilir.
CAM-DRG yönteminin kısa gözlem zaman dilimi de dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Embriyonun bağışıklık sistemi fizyolojik olarak günde 1827, ret ve enflamatuar bir süreç gerçekleşebilir, deneysel süreyi sınırlandırarak etkindir. Ayrıca, DRG ‘ye yakın tümör hücrelerini eritme mesafesini dikkate almak önemlidir; daha büyük DRG-Cancer mesafeler tümör hücreleri ve sinir arasındaki moleküler etkileşimleri zarar verebilir, ya da modelin her iki bileşeni arasında fiziksel temas geciktirebilir. Ayrıca, embriyolar Bu protokolde belirtilenden daha yaşlandıkça bu tümör hücrelerini ayırabilir. Bu nedenle, hücre grestleme için 10 gün sonrası fertilizasyon ile tutarlı yumurta kullanmak önemlidir.
Bağışıklık sistemi, 1827günden önce tam olarak gelişmemiş olduğundan, cam ‘deki tümör mikroortamı genellikle kanser çalışmaları için kullanılan immünolojik olarak bastırılmış murin modellerinin benzeridir. Bu nedenle, bu model tümör ilerlemesinde bağışıklık hücrelerinin rolünü değerlendirmek için yararlı değildir. Başka bir sınırlama, antikorlar, sitokinler ve astar gibi tavuk türleri için reaktiflerin kısıtlanmasıdır.
Bu protokol doğru şekilde gerçekleştirilmesi uygulama gerektirir; Ancak, özel bir çekirdek tesisi için gerek kalmadan bir laboratuvar üyesi tarafından yapılabilir. Yumurta kabuğu sondaj eğitim gerektirir. İlk kez bu model çalışmadan önce bakkal (döllenmeyen) yumurta üzerinde pratik tavsiye edilir. Yüksek embriyonik hayatta kalma ve modelin başarısı elde edilebilir eğer enfeksiyon önlemek için bazı kritik adımlar takip edilir:% 2 pen/strep içinde DRGs uygun antibiyotik profilaksi, bir laminar akış kabininde çalışan, ve yumurta kabuğu parçacıkları dağılımı kaçınarak CAM üzerine takın. Aynı zamanda toplam yumurta kuluçka süresi sırasında istikrarlı nem tutmak için çok önemlidir. Teknik hakim olana kadar grup başına yumurta sayısını artırmanızı öneririz. Deneyimsiz laboratuar personeli için en sık karşılaşılan sorunlar, hücre grerekleme için yumurta kontaminasyonu ve yanlış tekniktir.
DRG hasat da eğitim gerektirir; in vitro deneyler için DRGs hasat pratiği8 in vivo modeli denemeden önce önerilir. İn vitro DRG kültürü, koşulları optimize etmek ve DRG ekstraksiyon süresini kısaltmak için tekniği iyileştirmek için bir fırsattır. DRG ‘nin forseps ile yakalanırken hasat tekniğine özel dikkat gereklidir. DRG doğrudan tutulmamalıdır; altında basınç uygulanmalıdır. Biz daha iyi ekstraksiyon sırasında DRG görselleştirmek için Büyüteç objektif kullanımını öneririz.
Daha da önemlisi, bu modeli ilk kez gerçekleştirirken, tüm koşulların istenen hücre çizgisi için optimize edilmesi gerekir. Bu model Rat DRG ve HM-SCC-1 HNC hücre hattı için optimize edilmiştir. Fare DRG ve diğer kanser hücre türlerinin kullanımı optimizasyon gerektirebilir. Daha yüksek konsantrasyonlarda grepi hücreler, tümörlerin daha kalın ve daha sert büyümeye eğilimindedir, hangi tümör ölçümleri kolaylaştırır. Her bir grup için birden fazla yumurta ve her yumurta için uygun bir hücre konsantrasyonu dikkate alındığında, her deney için birkaç milyon hücre gerekebilir. Planlamanın kolaylaştırılması için hücrelerin ikiye katlama süresini dikkate almak gerekir. Bu protokoldeki bazı kritik adımlar için, bir sorun giderme tablosu sağlanır (Tablo 1).
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NıH/NıCR hibe DE027551 ve DE022567 (NJD) tarafından desteklenmektedir.
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |