Perineural 침략은 머리와 목 편평 상피 세포 암 및 그밖 종양을 위한 공격적인 표현형입니다. 병아리 융모난성 막 모형은 혈관신생, 암 침략 및 전이를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 여기에서 우리는 이 모형이 생체내 perineural 침략을 평가하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보여줍니다.
Perineural 침략은 암이 신경을 포위하거나 침입하는 표현형입니다. 그것은 머리와 목 편평 상피 세포 암 및 그밖 암을 위한 나쁜 임상 결과와 연관됩니다. 기계론적 연구는 신경과 종양 세포 사이 분자 누화는 물리적 상호 작용의 앞에 생깁니다. 물리 신경 종양 상호 작용이 발생하기 전에, 특히 초기 진행을 조사하기 위해, perineural 침략을 연구하는 생체 내 모델은 몇 가지가 있습니다. 병아리 융모알란토막 모델은 인간 상피 조직의 것을 모방하기 때문에, 외피 상피의 지하 막이 암 침략을 연구하기 위하여 이용되었습니다. 여기에서 우리는 골짜기 상피상에 쥐 등쪽 뿌리 중추 및 인간 머리 및 목 편평 상피 세포 세포를 이식하는 perineural 침략을 조사하기 위하여 병아리 chorioallantoic 막 모형을 용도를 변경했습니다. 우리는 이 모형이 생체 내에서 신경 조직을 침략하는 암세포의 기능을 평가하는 것이 유용할 수 있는 방법을 설명했습니다.
Perineural invasion (PNI)는 두경부 편평 세포 암종(HNC)을 가진 환자에서 높은 질병 재발 및 가난한 생존과 연관되는암에 있는 과소 평가된 표현형입니다 1. PNI는 신경내또는 주변 종양 세포로 현미경으로 정의 2,3. PNI가 검출되면, 환자는 선택적인 목 해부 및/또는 방사선 요법4,5와같은 보조 요법을 받을 가능성이 높습니다. 그러나, 이 치료는 공격적이고, PNI 특정이 아닙니다. 사실, PNI를 차단하는 치료법은 없으며, 주로 신경 종양 상호 작용의 근본적인 메커니즘이 여전히 제대로 이해되지 않았기 때문입니다.
다른 분자 메커니즘 신경 종양 매력에 연루 되었습니다.; 종양 및 기질 세포는 신경펩타이드와 신생을 촉진하는 성장인자를 방출6,7. 시험관 내에서 함께 배양할 때, HNC 세포와 등쪽 뿌리 중추 (DRG) 둘 다 강력한 반응을 갖는다; 종양 세포 침입 및 신생에 대한 효과는 배양 6,8,9에서며칠 후에 볼 수 있습니다. 그러나, 침략 의 앞에 종양 신경 상호 작용을 재량화하기 위하여 적당한 생체 내 모형의 부족이 있습니다. 여기에서 우리는 HNC 세포와 신경 사이 초기 상호 작용을 공부하기 위하여 생체 내 PNI 모형을 제출합니다6. 우리는 신경 성분을 포함하도록 병아리 융모암 막 (CAM) 모델을 적용하고, CAM에서 DRG를 이식하고, 암세포의 이식편을 이어서 내막 종양 미세 환경을 모방하였다.
CAM 모델은 암종과 흑색종의 초기 침습 단계를 모방하여 지하 막을 통해 세포의 침입을 평가하는 데 성공적으로 사용되었으며10,11,12. CAM은 상부 융모 상피, 중간엽, 하부 항인성 상피로 구성됩니다. 융모상피는 인간 상피10,13과 구조적으로 유사하며 콜라겐-IV가 풍부한 지하막은 경구 상피를 기본 결합 조직으로부터 분리하는 지하 막을 시뮬레이션한다는 점에서. 1913년14년CAM에서 첫 종양 이식편이 수행된 이래, 혈관신생15,16,17,종양 진행의 평가를 가능하게 하는 방법의 많은 적응이 개발되었다. 전이18. 중요한 것은, CAM에 종양을 이식하는 기술은 아주 조금 변경되었습니다, 그러나 응용은 지속적으로 발전하고 있습니다. 약물 스크리닝19,골조직 공학20,나노입자 기반 항암제(21) 등 복잡성이 증가하는 것으로 발표되었다.
우리의 실험실은 포유류 DRG가 격리되고 상부 CAM의 표면에 접목되는 CAM-DRG 모델을 사용합니다. DRG가 CAM에 통합된 후, HNC 세포는 DRG 근처에서 이식되고 전체 생체 내 시스템을 수확하고 분석하기 전에 DRG와 상호 작용할 수 있습니다. 중요한 것은, 시스템은 DRG 및 종양 세포의 형광 표지에 의하여 DRG 및 종양 둘 다의 전 생체내 시각적 관찰을 허용합니다. 이 프로토콜은 계란 배양에서 CAM 수확에 이르기까지 17 일 이내에 수행 된복잡성의 상이한 수준을 가진 여러 단계로 구성됩니다 (그림 1). 관심있는 다른 단백질을 표현하는 세포는 암에 있는 신경 침략에 책임 있는 분자 통로를 해명하기 위하여 이 모형에서 시험될 수 있고, 또한 신경 침략을 직접 표적으로 하는 약을 검열하기 위하여. 후보 약물로 전처리된 세포는 치료되지 않은 대조군과 비교하여 조사된 CAM 및 PNI의 발생에 이식될 수 있다. 실제로, CAM 모델은 설치류19에서생체 외 내 연구와 전 임상 시험 사이의 중간 단계로 약물 스크리닝에 사용되어 왔다.
실험 설계는 가설에 따라 달라집니다. 예를 들어, PNI에서 특정 단백질의 역할을 테스트하는 경우, 실험군은 단백질을 과발현하는 종양 세포로 이식된 DRG를 포함하지만, 대조군은 빈 벡터로 안정적으로 형질감염된 세포를 가진 DRG를 포함해야 한다. 여러 가지 다른 실험 설계를 사용하여 특정 질문을 해결할 수 있습니다.
여기에 제시된 생체 내 CAM-DRG 모델은 종양 세포에 의한 신경의 물리적 침입 전에 신경 종양 상호 작용을 입증함으로써 이전 모델의 적자를 해결합니다. PNI의 대부분의 생체 내 연구는 종양 확산 및 운동 기능 억제에 초점을 맞추고, 종양 세포를 직접 시골 신경으로 주입하는 데 의존한다23,24,25. 자골신경 주사는 암세포가 마우스 또는 쥐 심막 신경으로 주입되는 PNI의 생체 내 모델이며 종양이 이후에 증가합니다. 주사 모델은 신경 내의 종양 세포에서 유래하는 파괴적인 종양 진행 및 고통을 보여주기 위하여 유용합니다. sciatic 신경 모형은 또한 암세포가 신경에서 번창하는 것을 허용하는 요인의 연구 결과에서 적당합니다 그러나 신경으로 직접 세포를 소개하기 때문에, 신경에 직접 세포를 소개하기 때문에 PNI의 초기 단계를 평가하는 기능이 부족합니다, 신경 칼집을 우회하. 다른 접근법에서, 외과적으로 이식된 정형외과 종양 이식은 전립선암 진행을 촉진하는 아드레날린 및 해 신경 섬유의 중요성을 특성화하기 위하여 이용되었습니다, 따라서 종양 진행에 있는 신경의 중요한 역할을 건의하 26. 이 모델은 뮤린 교감 및 부교감 신경의 화학적 절제로 구성되었습니다. 부교감 섬유는 종양 조직, PNI와 관련된 과정에 침투했지만, 모델은 신경과 종양 사이의 물리적 상호 작용을 평가하기 위해 특별히 사용되지 않았다. CAM-DRG 모델은 PNI 동안 신경과 암 사이의 상호 작용의 조사를 할 수 있습니다. 또한 뮤린 모델은 CAM 모델과 비교할 때 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 우리는 PNI의 기계론적 연구에 CAM-DRG 모델을 사용하는 것이 좋습니다.
CAM-DRG 접근법에 대한 몇 가지 이점은 종양 성장, 전이 및 혈관신생과 같은 PNI 및 다른 표현형의 평가를 포함한다. 하부 CAM 및/또는 간에서 인간 DNA의 식별은 인간 암 세포주(10)의 전이를 검출하는데 사용될 수 있으며, 이는 작은 전이를 드러내지 않을 수 있는 조직 단면화 및 염색에 비해 보다 민감한 실험접근법이다.
CAM-DRG 방법은 짧은 관찰 시간 프레임을 포함하여 몇 가지 제한사항이 있습니다. 배아의 면역 계통은 1827일까지생리적으로 활성화되며, 거부및 염증 과정이 일어날 수 있을 때, 실험 시간을 제한한다. 또한 DRG에 가까운 종양 세포를 이식할 때 거리를 고려하는 것이 중요합니다. 더 큰 DRG 암 거리는 종양 세포와 신경 사이 분자 상호 작용을 손상시킬 수 있고, 또는 모형의 두 분대 사이 물리적 접촉을 연기할 수 있었습니다. 또한, 배아가 이 프로토콜에 규정된 것보다 오래된 경우에, 태아 운동은 종양 세포를 대체할 수 있습니다. 따라서 세포 이식을 위해 10 일째 수정 후 일과 일치하는 계란을 사용하는 것이 중요합니다.
면역 계통이 1827일전에 완전히 개발되지 않기 때문에, CAM내의 종양 미세환경은 암 연구에 자주 사용되는 면역억제 뮤린 모델의 종양 미세환경과 유사하다. 따라서, 이 모델은 종양 진행에서 면역 세포의 역할을 평가하는 데 유용하지 않다. 또 다른 제한은 항체, 사이토카인 및 프라이머와 같은 닭 종에 대한 시약의 제한된 가용성입니다.
이 프로토콜을 정확하게 수행하려면 연습이 필요합니다. 그러나 전문 핵심 시설없이 실험실 구성원이 수행 할 수 있습니다. 달걀 껍질을 시추하려면 훈련이 필요합니다. 처음으로이 모델을 시도하기 전에 식료품 (비 수정) 계란을 연습하는 것이 좋습니다. 감염을 피하기 위해 몇 가지 중요한 단계를 따르는 경우 모델의 높은 배아 생존과 성공을 달성 할 수있다 : 2 % 펜 / 스트렙에서 DRGs의 적절한 항생제 예방, 층류 캐비닛에서 작업, 계란 껍질 입자의 분산을 피하기 CAM에. 또한 총 계란 배양 시간 동안 안정적인 습도를 유지하는 것이 중요합니다. 기술을 마스터할 때까지 그룹당 계란 수를 늘리는 것이 좋습니다. 경험이 없는 실험실 직원에게 가장 빈번한 문제는 계란 오염과 세포 이식에 대한 부정확한 기술입니다.
DRG 수확은 또한 훈련이 필요합니다; 생체 외 에서 실험을 위한 DRGs를 수확에 연습8 생체 내 모델을 시도 하기 전에 권장. 시험관 내 DRG 배양은 DRG 추출 기간을 단축하기 위해 조건을 최적화하고 기술을 향상시킬 수있는 기회입니다. 집게로 DRG를 잡을 때 수확 기술에 특별한주의가 필요합니다. DRG를 직접 개최해서는 안됩니다. 밑에 압력을 가해야 합니다. 추출 하는 동안 DRG를 더 잘 시각화 하려면 돋보기 렌즈를 사용 하는 것이 좋습니다.
중요한 것은 이 모델을 처음으로 수행할 때 원하는 세포주에 대해 모든 조건을 최적화해야 한다는 것입니다. 이 모델은 랫트 DRG 및 HNC 세포주 UM-SCC-1에 최적화되었다. 마우스 DRG 및 그밖 암 세포 모형의 사용은 최적화를 요구할 수 있습니다. 접목 된 세포의 높은 농도로, 종양은 종양 측정을 용이하게 두껍고 뻣뻣하게 성장하는 경향이있다. 각 그룹에 대한 여러 개의 계란과 각 난자를 위한 세포의 적절한 농도를 고려하여, 각 실험에 대해 수백만 개의 세포가 필요할 수 있습니다. 계획을 용이하게하기 위해 세포의 두 배 시간에 대한 지식을 고려해야합니다. 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계의 경우문제 해결 테이블이 제공됩니다(표 1).
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH / NIDCR 보조금 DE027551 및 DE022567 (NJD)에 의해 지원되었다.
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |