L’invasion perineural est un phénotype agressif pour les carcinomes squamous de tête et de cou de cellules et d’autres tumeurs. Le modèle de membrane chorioallantoic de poussin a été employé pour étudier l’angiogenèse, l’invasion de cancer, et la métastasie. Ici nous démontrons comment ce modèle peut être utilisé pour évaluer l’invasion perineural in vivo.
L’invasion périnéale est un phénotype dans lequel le cancer entoure ou envahit les nerfs. Il est associé à de mauvais résultats cliniques pour le carcinome épidermoïde de tête et de cou et d’autres cancers. Des études mécanistes ont montré que le croisement moléculaire entre les nerfs et les cellules tumorales se produit avant l’interaction physique. Il n’y a que quelques modèles in vivo pour étudier l’invasion périneural, particulièrement pour étudier la progression tôt, avant que les interactions nerveuses-tumorales physiques se produisent. Le modèle de membrane chorioallantoic de poussin a été employé pour étudier l’invasion de cancer, parce que la membrane de sous-sol de l’épithélium chorionique imite cela du tissu épithélial humain. Ici nous avons réconçu le modèle chorioallantoic de membrane de poussin pour étudier l’invasion perineural, greffant des ganglions de racine dorsal de rat et les cellules humaines de carcinome squamous de tête et de cou sur l’épithélium chorionique. Nous avons démontré comment ce modèle peut être utile pour évaluer la capacité des cellules cancéreuses à envahir le tissu neural in vivo.
L’invasion perineural (PNI) est un phénotype sous-étudié dans le cancer, qui est associé à la répétition élevée de la maladie et à la survie pauvre dans les patients présentant le carcinome squamous de tête et de cou (HNC)1. PNI est défini au microscope comme des cellules tumorales à l’intérieur ou autour des nerfs2,3. Lorsque le PNI est détecté, les patients sont susceptibles de recevoir des thérapies adjuvantes telles que la dissection élective du cou et/ ou la radiothérapie4,5. Cependant, ces thérapies sont agressives, et non spécifiques à PNI. En fait, il n’y a aucune thérapie pour bloquer PNI, principalement parce que les mécanismes sous-jacents des interactions nerf-tumeur sont encore mal compris.
Différents mécanismes moléculaires ont été impliqués dans l’attraction de nerf-tumeur ; les tumeurs et les cellules stromales libèrent des neuropeptides et des facteurs de croissance pour favoriser la neuritogenesis6,7. Lorsqu’ils sont cultivés ensemble in vitro, les cellules HNC et les ganglions de racine dorsal (DRG) ont tous deux une réponse robuste ; effets sur l’invasion des cellules tumorales et la néuritogénèse peut être vu après quelques jours dans la culture6,8,9. Cependant, il y a un manque de modèles in vivo appropriés pour récapituler des interactions tumeur-nerf avant invasion. Ici, nous présentons un modèle In vivo PNI pour étudier les interactions précoces entre les cellules HNC et les nerfs6. Nous avons adapté le modèle de membrane chorioallantoic de poussin (CAM) pour inclure un composant neural, greffant un DRG dans le CAM, suivi d’une greffe des cellules cancéreuses pour imiter un microenvironnement innervé de tumeur.
Le modèle CAM a été utilisé avec succès pour évaluer l’invasion des cellules à travers la membrane du sous-sol, imitant les premiers stades invasifs des carcinomes et du mélanome10,11,12. Le CAM est composé de l’épithélium chorionique supérieur, du mésenchyme intervenant, et de l’épithélium allantoïque inférieur. L’épithélium chorionique est structurellement similaire à l’épithélium humain10,13 en ce que la membrane de sous-sol riche en collagène IV simule la membrane du sous-sol qui sépare l’épithélium oral du tissu conjonctif sous-jacent. Depuis les premières greffes de tumeur ont été effectuées dans le CAM en 191314, de nombreuses adaptations de la méthode ont été développées pour permettre l’évaluation de l’angiogenèse15,16,17, progression tumorale, et métastase18. Fait important, la technique de greffe des tumeurs sur le CAM a très peu changé, mais les applications sont en constante évolution. Des essais de complexité croissante ont été publiés, y compris le dépistage des médicaments19, l’ingénierie des tissus osseux20, et les médicaments anticancéreux à base de nanoparticules21.
Notre laboratoire utilise un modèle CAM-DRG dans lequel un DRG de mammifères est isolé et greffé sur la surface de la CAM supérieure. Une fois que le DRG est incorporé dans le CAM, les cellules HNC sont greffées près du DRG et autorisées à interagir avec le DRG avant que l’ensemble du système in vivo ne soit récolté et analysé. Fait important, le système permet l’observation visuelle ex-vivo du DRG et de la tumeur par l’étiquetage de fluorescence des cellules d’Adn et de tumeur. Ce protocole comprend plusieurs étapes avec différents niveaux de complexité effectuées dans les 17 jours, de l’incubation des œufs à la récolte de la CAM (Figure 1). Les cellules exprimant différentes protéines d’intérêt peuvent être testées dans ce modèle pour élucider les voies moléculaires responsables de l’invasion nerveuse dans le cancer, et aussi pour le dépistage des médicaments pour cibler directement l’invasion neuronale. Les cellules prétraitées avec un médicament candidat peuvent être greffées sur la MCA et l’apparition de PNI étudiée par rapport aux contrôles non traités. En fait, le modèle CAM a été utilisé pour le dépistage des médicaments comme une étape intermédiaire entre les études in vitro et les essais précliniques in vivo chez les rongeurs19.
La conception expérimentale variera en fonction de l’hypothèse. Par exemple, si l’essai du rôle d’une protéine spécifique sur PNI, le groupe expérimental inclurait DRG greffé avec des cellules de tumeur surexprimant la protéine, alors que le groupe témoin devrait inclure DRG avec des cellules poignardées transfected avec le vecteur vide. Plusieurs conceptions expérimentales différentes peuvent être utilisées pour répondre à des questions spécifiques.
Le modèle in vivo de CAM-DRG présenté ici traite des déficits des modèles précédents en démontrant l’interaction nerf-tumeur avant l’invasion physique du nerf par des cellules de tumeur. La plupart des études in vivo de PNI se concentrer sur la propagation tumorale et l’inhibition de la fonction motrice, et dépendent de l’injection directe de cellules tumorales dans les nerfs sciatiques23,24,25. L’injection de nerf sciatique est un modèle in vivo de PNI où les cellules cancéreuses sont injectées dans une souris ou un nerf sciatique de rat où la tumeur se développe plus tard. Les modèles d’injection sont utiles pour montrer la progression destructrice de tumeur et la douleur résultant des cellules de tumeur dans des nerfs. Le modèle de nerf sciatique est également approprié pour l’étude des facteurs qui permettent aux cellules cancéreuses de prospérer dans le nerf mais n’a pas la capacité d’évaluer la phase tôt de PNI, parce qu’il introduit des cellules directement dans le nerf, contournant des gaines nerveuses. Dans une approche différente, les greffes orthotopic chirurgicalement implantées de tumeur ont été employées pour caractériser l’importance des fibres adrénergiques et cholinergiques de nerf en favorisant la progression de cancer de la prostate, suggérant ainsi un rôle en avant des nerfs dans la progression de tumeur 26. Ce modèle s’est composé de l’ablation chimique des nerfs sympathiques et parasympathiques murines. Les fibres parasympathiques ont infiltré les tissus tumoraux, un processus lié à PNI, mais le modèle n’a pas été spécifiquement utilisé pour évaluer les interactions physiques entre le nerf et la tumeur. Le modèle CAM-DRG permet d’enquêter sur les interactions entre le nerf et le cancer pendant le PNI. De plus, les modèles de murine sont coûteux et prennent beaucoup de temps par rapport au modèle CAM. Nous suggérons d’utiliser le modèle CAM-DRG pour des études mécanistes de PNI.
Quelques avantages à l’approche de CAM-DRG incluent l’évaluation du PNI et d’autres phénotypes, tels que la croissance de tumeur, la métastasie, et l’angiogenèse. L’identification de l’ADN humain sur le CAM inférieur et/ou dans le foie peut être employée pour la détection de métastases des lignées humaines de cellules cancéreuses10,une approche expérimentale plus sensible comparée à la section et à la coloration de tissu, qui peuvent ne pas indiquer de petites métastases.
La méthode CAM-DRG comporte certaines limites, y compris le court laps de temps d’observation. Le système immunitaire de l’embryon est physiologiquement actif au jour 1827, lorsque le rejet et un processus inflammatoire peuvent avoir lieu, limitant le temps expérimental. Il est également important de considérer la distance en greffant des cellules de tumeur près du DRG ; de plus grandes distances DRG-cancer pourraient altérer les interactions moléculaires entre les cellules tumorales et le nerf, ou pourraient retarder le contact physique entre les deux composants du modèle. En outre, si les embryons sont plus âgés que stipulé dans ce protocole, les mouvements d’embryon pourraient déplacer les cellules tumorales. Par conséquent, il est important d’utiliser des œufs compatibles avec le jour 10 post-fertilisation pour la greffe cellulaire.
Puisque le système immunitaire n’est pas entièrement développé avant le jour 1827,le microenvironnement de tumeur dans le CAM est semblable à celui des modèles murins immunosuppressed souvent employés pour des études de cancer. Par conséquent, ce modèle n’est pas utile pour évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la progression tumorale. Une autre limite est la disponibilité restreinte de réactifs pour les espèces de poulet, comme les anticorps, les cytokines et les amorces.
L’exécution précise de ce protocole exige la pratique ; cependant, il peut être fait par un membre de laboratoire sans avoir besoin d’une installation de base spécialisée. Le forage de la coquille d’œuf nécessite une formation. Il est recommandé de pratiquer des œufs à l’épicerie (non fécondés) avant de tenter ce modèle pour la première fois. La survie embryonnaire élevée et le succès du modèle peuvent être atteints si certaines étapes critiques pour éviter l’infection sont suivies : prophylaxie antibiotique appropriée des DRG dans 2% Pen/Strep, travaillant dans une armoire à débit laminaire, et évitant la dispersion des particules de coquille d’oeuf sur le CAM. Il est également crucial de maintenir une humidité stable pendant le temps total d’incubation des œufs. Nous recommandons d’augmenter le nombre d’œufs par groupe jusqu’à ce que la technique soit maîtrisée. Les problèmes les plus fréquents pour le personnel de laboratoire inexpérimenté sont la contamination des œufs et la technique inexacte pour la greffe de cellules.
La récolte de DRG exige également la formation ; pratique dans la récolte des DrG pour les expériences in vitro8 avant de tenter le modèle in vivo est recommandée. La culture DRG in vitro est l’occasion d’optimiser les conditions et d’améliorer la technique pour raccourcir la durée de l’extraction DRG. Une attention particulière à la technique de récolte est nécessaire lors de la saisie du DRG avec des forceps. Le DRG ne doit pas être tenu directement; pression doit être appliquée en dessous. Nous recommandons l’utilisation de la lentille grossissante pour mieux visualiser le DRG pendant l’extraction.
Fait important, lors de l’exécution de ce modèle pour la première fois, toutes les conditions doivent être optimisées pour la ligne cellulaire désirée. Ce modèle a été optimisé pour le rat DRG et la lignée cellulaire HNC UM-SCC-1. L’utilisation de la souris DRG et d’autres types de cellules cancéreuses peut nécessiter une optimisation. Avec une concentration plus élevée de cellules greffées, les tumeurs ont tendance à devenir plus épaisses et plus rigides, ce qui facilite les mesures tumorales. Compte tenu des œufs multiples pour chaque groupe et d’une concentration appropriée de cellules pour chaque œuf, plusieurs millions de cellules peuvent être nécessaires pour chaque expérience. Pour faciliter la planification, la connaissance du temps de doublement des cellules doit être prise en considération. Pour certaines étapes critiques de ce protocole, une table de dépannage est fournie (tableau 1).
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les subventions DES NIH/NIDCR DE027551 et DE022567 (NJD).
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |