Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan – beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.
Nörovasküler birimi (NVU) mikrovasküler endotel hücrelerinin kan – beyin bariyerini (BBB), bir endotel membran ile katıştırılmış perisitlerden, şekillendirme oluşmaktadır ve glia limitans parenkima membran ve astrositik oluşur son-besleme merkezi sinir sistemi (MSS) yüzdeki abluminal yönünü kucaklayan. CNS sürdürmenin yanı sıra homeostazı NVU bağışıklık hücre MSS kaçakçılığı kontrol eder. MSS immunosurveillance sırasında aktive lenfositler az sayıda BBB disfonksiyon ya da klinik hastalığı neden olmadan endotel bariyer geçebilir. Buna ek olarak, multipl skleroz veya hayvan onun modeli gibi neuroinflammation sırasında deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) çok sayıda bağışıklık hücreleri BBB ve daha sonra sonunda CNS parankimi ulaşan glia limitans geçebilir Klinik hastalık için önde gelen. Bağışıklık hücre göç CNS parankimi içine böylece ayrı moleküler mekanizmaları istihdam NVU endotel ve gliyal bariyer arasında sıralı bir geçiş içeren bir işlemdir. Endotel bariyer arasında geçiş takip, T hücreleri kendi yerel etkinleştirme başlatmak sonraki mekanizmaları jelatinin, Fokal harekete geçirmek için önde gelen Perivasküler antijen sunan hücreler üzerinde onların soydaş antijen karşılaşmak hangi gliyal bariyer çapraz ve CNS parankimi girmek T hücreleri sağlayacaktır. Böylece, hem, BBB geçirgenliği ve MMP aktivite sırasında EAE MSS bağışıklık hücre birikimi için mekansal ilişki içinde değerlendirilmesi NVU endotel ve gliyal engelleri bütünlüğünü kaybı belirtmenizi sağlar. Biz burada EAE C57BL/6 fareler tarafından Aktif bağışıklama ikna etmek ve daha sonra analiz BBB geçirgenliği içinde vivo eksojen floresan tarayıcıları kullanarak gösterir. Biz daha fazla göstermek nasıl görselleştirmek ve yerinde zymogaphy BBB Bodrum membranlar ve CD45 + işgal bağışıklık hücreleri immünfloresan stainings birleştiğinde tarafından gelatinase aktivite EAE beynindeki yerelleştirilmesine.
Tüm vücut ve zihinsel fonksiyonları omurgalılarda merkezi sinir sistemi (MSS) koordinatları ve CNS homeostazı nöronlar uygun bir iletişim için esastır. CNS homeostazı MSS kan akışı değişen çevre korur nörovasküler birimi (NVU), tarafından garanti kapsamındadır. NVU biyokimyasal olarak benzersiz ve kan – beyin bariyerini (BBB) perisitlerden, astrocytes, sinir hücreleri ve hücre dışı Matriks (ECM) bileşenleri ile sürekli crosstalk kurmak, CNS mikrovasküler endotel hücreleri, iki kurulması oluşur farklı Bodrum membranlar1. Endotel membran o ensheathes BBB endotel hücreleri ve abluminal yönü perisitlerden yüksek sayıda limanlar ve laminin α4 ve ek olarak diğer ECM proteinler2laminin α5 oluşmaktadır. Buna ek olarak, parenkimal membran laminin α1 ve laminin α2 oluşur ve astrositik sonu-ayak tarafından kucakladı. Astrocyte sonu-ayakları ile birlikte parenkima membran serebrospinal sıvı dolu Perivasküler veya subaraknoid boşluk3CNS nöronal ağdan segregates glia limitans oluşturur. NVU eşsiz mimarisi nedeniyle bağışıklık hücre MSS ticareti bir işlemdir bağışıklık hücreleri ile gerektirir gibi periferik dokulara ilk endotel BBB ve daha sonra glia limitans için ihlal olduğunu ayrıdır CNS parankimi ulaşmak.
Multipl skleroz (MS) bağışıklık hücreleri dolaşan çok sayıda MSS girin ve neuroinflammation, demiyelinizasyon ve BBB bütünlüğü4odak kaybına neden MSS, ortak bir neuroinflammatory hastalıktır. BBB bütünlüğü kaybı bir erken MS, gadolinyum kontrast olarak görüntülenmeyecektir manyetik rezonans görüntüleme (MRG)5MSS lezyonlarının artırılması varlığı tarafından belirtildiği şekilde özelliğidir. Lökosit ekstravazasyonu içine MSS postkapiller venüller düzeyinde gerçekleşir; Ancak, keşfedilmeyi kesin mekanizmaları bağışıklık hücre diapedesis BBB membran ve daha sonra gliyal bariyer arasında yer kalır. Deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) MS için hayvan bir model olarak hizmet vermektedir ve önemli ölçüde bizim mevcut bilgi hakkında MS patogenezinde katkıda bulunmuştur. Örneğin, EAE modelini kullanarak bu ilk bir yakalama dahil olmak üzere multistep bir işlemde lökosit ekstravazasyonu oluşur ve adım haddeleme tarafından selectins ve müsin benzeri moleküllerin glikoprotein ligand (PSGL) -1, P-selektin gibi aracılı keşfedilmiştir integrin bağımlı firma tutuklama ve T hücrelerinin diapedesis6için izin veren iki taraf için de BBB endotel hücreleri üzerinde tarama tarafından izlenen.
T hücreler endotel BBB ve endotel membran geçti sonra onların soydaş antijen makrofajlar veya stratejik leptomeningeal veya Perivasküler boşluklara lokalize dendritik hücreler karşılaşmaya ihtiyaçları var. Bu etkileşim pro-inflamatuar aracılar odak üretim sonraki mekanizmaları via glia limitans7,8,9bağışıklık hücreleri CNS doku işgali için gereken tetiği neden olmaktadır. Matriks metalloproteinazların (MMP) -2 ve MMP-9 odak harekete geçirmek Kemokin harekete geçirmek değiştirir ve bağışıklık için bir önkoşuldur bozulması astrocyte sonu-ayakları, hücre dışı matriks reseptörlerinin indükler glia limitans arasında geçiş hücre CNS parankimi ve klinik belirtiler EAE10,11başlangıcı ikna etmek için.
BBB ile bağışıklık hücre infiltre CNS tespiti birleştiren CNS doku bölümlerde kaçağı ve gelatinase etkinliği bağlamında neuroinflammation, endotel ve gliyal bariyer işlevsel bütünlüğü hakkında değerli bilgiler sağlar. Örneğin, biz son zamanlarda araştırdık endotelyal sıkı kavşak molekül bileske adezyon molekülü (reçel) kurucu kaybı-B bağışıklık hücre MSS EAE bağlamında kaçakçılığı. Sağlıklı vahşi tipli C57BL/6 fareler için karşılaştırıldığında, sağlıklı reçel B eksikliği littermates BBB bütünlüğü hiçbir bozulma endojen gibi eksojen izleyiciler12kullanarak içinde vivo geçirgenliği değerlendirme tarafından gösterildiği gibi gösterdi. EAE bağlamında, reçel-B-eksik C57BL/6 fareler iyileştirmiştir hastalık belirtileri, hangi inflamatuar hücre bindirme leptomeningeal ve Perivasküler alanlarda12ile ilişkili olduğunu gösterdi. Bu fenomen incelemek için biz in situ zymography, gelatinase faaliyetlerin tanımlaması reçel B eksikliği farelerde gelatinase aktivite eksikliği bağışıklık hücreleri aşmak mümkün sınırlı sayıda için sorumlu olabilir eğer test etmek için izin uygulanır glia limitans12.
Durumu göz önüne alındığında farklı genetik olarak eksik, örneğin, değişiklikleri BBB işlevinde neden olabilir farklı BBB sıkı kavşak molekül modelleri için BBB bütünlüğü araştırıyor metodolojileri önemlidir fare değiştirilmiş. Buna ek olarak, yeni geliştirilen ilaçlar NVU engelleri üzerinde etkisi olabilir. Burada biz EAE C57BL/6 farelerde miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) ile Aktif bağışıklama tarafından ikna etmek nasıl göstereceğim-peptid aa35-55 tam Freund’ın adjuvan olarak. Biz o zaman bağışıklık hücre infiltrasyonu NVU endotel ve gliyal engelleri arasında yerelleştirilmesine ve içinde vivo endotel ve gliyal bariyer bütünlüğünü eksojen izleyiciler ve gelatinase etkinlik, yerinde tespiti tarafından sırasıyla çalışma açıklanmaktadır.
Burada, teşvik ve kadın C57BL/6 farelerde EAE izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Kadın tercihen seçilir ve orada kadınlar insidansı: Erkekler 3:1 MS. EAE şiddetini değerlendirmek için yaptığımız bir 3-nokta skor sayfası kullanın. EAE önem genellikle motor işlev bozuklukları önem derecesi ile ilgili olarak attı. EAE aşamalarında fare ile gelişmiş, yani 2 üzerinde bir skor sergilenmesi hayvanların gereksiz acı önlemek için feda. Böylece, bu fareler yakın aralıklarla örneğin puanı…
The authors have nothing to disclose.
Ona orijinal in situ zymography protokolü10 bizimle paylaştı Lydia Sorokin minnetle anıyoruz.
AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |