概要

Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros

Published: January 07, 2019
doi:

概要

Aquí, presentamos un protocolo para construir laboratorio burbuja columna fotobiorreactores y usarlos para cultivo de microalgas. También proporciona un método para la determinación de la tasa de crecimiento del cultivo y el contenido de lípidos neutros.

Abstract

Hay gran interés en el estudio de las microalgas para aplicaciones de ingeniería tales como la producción de biocombustibles, productos de alto valor y para el tratamiento de residuos. Medida más nuevos esfuerzos de investigación a escala de laboratorio, hay una necesidad de métodos rentables para el cultivo de microalgas de forma reproducible. Aquí, nos comunicamos un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en fotobiorreactores de escala de laboratorio y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. También se incluyen instrucciones sobre cómo configurar el sistema de fotobiorreactor. Aunque los organismos ejemplo son especies de Chlorella y Auxenochlorella, se puede adaptar este sistema para cultivar una amplia gama de microalgas, incluyendo co-cultivos de algas con las especies de algas no. Culturas comunes se cultivan primero en botellas para producir inóculo para el sistema del fotobiorreactor. Inóculo de algas se concentra y transferido a fotobiorreactores para el cultivo en lotes. Las muestras se recogen diariamente de las lecturas de densidad óptica. Al final de la cultura de la hornada, las células se cosechan por centrífuga, lavado y liofilizado para obtener una concentración de peso seco final. La concentración de peso seco final se utiliza para crear una correlación entre la densidad óptica y la concentración de peso seco. Un método modificado de Folch se utiliza posteriormente para extraer los lípidos totales de la biomasa liofilizada y el extracto es analizado por su contenido de lípido neutral usando un análisis de la microplaca. Este ensayo ha sido publicado anteriormente pero pasos de protocolo se incluyeron aquí para destacar los pasos críticos en el procedimiento donde se producen frecuentemente errores. El sistema de biorreactor descrito aquí llena un nicho entre cultivo frasco simple y biorreactores comerciales totalmente controlado. Incluso con sólo 3-4 biológicos repeticiones por tratamiento, nuestro acercamiento al cultivo de algas conduce a desviaciones de estándar ajustadas en los ensayos de crecimiento y de los lípidos.

Introduction

El uso de microalgas en ingeniería y biotecnología ha atraído gran interés en los últimos años. Microalgas se están estudiando para el uso en aguas residuales tratamiento1,2,3,4, biocombustibles producción5,6,7,8y el producción de nutracéuticos y otros productos de alto valor9,10. Las algas también se están modificando genéticamente a mayores tasas en un esfuerzo por mejorar su idoneidad para aplicaciones ingeniería específica11,12 En consecuencia, hay gran interés en la experimentación con organismos industrialmente relevantes en entornos controlados. El propósito de este método es para comunicar un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en un entorno de laboratorio controlado y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. Mejorar el crecimiento de las tasas y el contenido de lípido neutral de microalgas han sido identificados como dos cuellos de botella claves hacia la comercialización de biocombustibles de algas13.

Una amplia gama de enfoques se han utilizado a las algas de la cultura para los propósitos experimentales. En general, estos enfoques se pueden dividir entre cultivo al aire libre a gran escala y pequeña escala cultivo interior. Cultivo al aire libre en estanques abiertos y en fotobiorreactores es apropiado para la experimentación a la intensificación de procesos que ya han sido probados a escala de laboratorio (por ejemplo, para probar a escala de una nueva cepa de alta de lípidos de algas)14. Sin embargo, el cultivo en pequeña escala interior es apropiado al desarrollo de cepas de algas nuevos o mejorados o realizar experimentos dirigidos a comprender los mecanismos biológicos. En estos últimos casos, es necesaria un alto grado de control experimental para provocar cambios sutiles en el comportamiento biológico. Para ello, cultivos axénicos a menudo se requieren para reducir al mínimo los complejos factores bióticos asociados con otros organismos (e.g. bacterias, otras algas) que inevitablemente crecen en sistemas al aire libre a gran escala. Incluso al estudiar las interacciones entre algas y otros organismos, hemos encontrado que el uso de condiciones experimentales altamente controladas es útil al examinar el intercambio molecular entre los organismos15,16,17.

Dentro de la categoría de cultivo de algas interiores en pequeña escala, se han utilizado una variedad de enfoques. Quizás el método más común es crecer algas en matraces de Erlenmeyer sobre una mesa coctelera debajo de un banco de luz18,19. Intercambio de oxígeno y CO2 lleva a cabo por difusión pasiva a través de un tapón de espuma en la parte superior del frasco. Algunos investigadores han mejorado este montaje una aireación activa de los matraces20. Otro método es cultivar algas en botellas, mezcladas por barra de agitación y aireación activa. A pesar de su sencillez, hemos encontrado que el uso de frascos y botellas a menudo conduce a resultados inconsistentes entre los distintos recipientes biológicos. Probablemente esto es debido a los efectos de la posición – posiciones reciben diferentes cantidades de luz, que también afectan las temperaturas del interior del reactor. Rotación diaria de reactores a nuevas posiciones puede ayudar pero no solucionar el problema porque ciertas etapas de crecimiento de las algas (por ejemplo, temprano exponencial) son más sensibles a efectos posicionales que otros (p. ej., fase de registro).

En el lado opuesto del espectro de la sofisticación tecnológica son fotobiorreactores comercial totalmente controlado. Estos sistemas continuamente monitorea y regula las condiciones en el reactor para optimizar el crecimiento de algas. Tienen iluminación programable, control de temperatura en tiempo real y control del pH. Por desgracia, son caros y por lo general cuestan varios miles de dólares por el reactor. Más revistas científicas y de ingeniería requieren replicación biológica de resultados, lo que requeriría la compra de varios Biorreactores. Aquí os presentamos un sistema de reactor de columna de burbujas que une la brecha entre el simple (matraz) y sofisticado (biorreactor totalmente controlado) se acerca para el cultivo de algas de escala de laboratorio. Columnas de burbujas utilizan burbujas de gas de levantamiento para facilitar el intercambio de gases y mezcla del reactor. Este enfoque proporciona cierto grado de control sobre la iluminación y la temperatura pero lo hace de una manera rentable. Por otra parte, hemos encontrado este sistema para producir resultados muy consistentes entre los distintos recipientes biológicos, reduciendo el número de repeticiones biológicos necesarios para obtener resultados estadísticamente significativos en comparación con el método de frasco o botella. También hemos utilizado este sistema para cultivar con éxito mezclas de algas y bacterias21. Además de cultivo de algas, describiremos un procedimiento para medir el contenido de lípidos neutros en las algas cultivadas. Este último método ha sido publicado en otro lugar22, pero incluimos aquí el procedimiento para proporcionar instrucciones paso a paso sobre cómo utilizar con éxito.

Protocol

1. configuración de fotobiorreactores de columna de burbuja Construir un conjunto de tapas ventiladas de las tapas de plástico que viene con las botellas de vidrio de 1 L y tubos de hibridación (véase figura 1 esquema y fotos). La construcción de las tapas para el humidificador, trampa, cada aire ascensor fotobiorreactor y cada reactor botella de mezcla. ¼” agujeros en la tapa: 2 agujeros son necesarios para las tapas de bioreactor y el humidificador; 3 agujeros se ne…

Representative Results

Este procedimiento produce un curso de tiempo de datos de algas densidad óptica OD 550 nm (Figura 4A). La densidad óptica y peso seco de concentración pueden ser datos correlacionados (Figura 4B). Esto se logra mediante el primer cálculo de la concentración de algas de peso seco final después del paso de liofilización. A continuación, puede correlacionarse la densidad óptica de la dilución serial de cultura (realizado e…

Discussion

La consideración más importante al cultivo de algas es un entendimiento de las necesidades específicas del organismo o grupo de organismos. Las algas en el sistema de cultivo aquí descrito puede utilizarse para una amplia gama de las algas pero los específicos factores abióticos (temperatura, media, pH, intensidad de luz, nivel de CO2 , tasa de aireación) de la cultura deben ajustarse a las necesidades del organismo. Tenga en cuenta los parámetros aquí descritos fueron utilizados para el cultivo de <e…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Apoyo para esta investigación fue proporcionada por el Instituto Nacional de alimentos de USDA y agricultura Portilla proyecto ALA0HIGGINS y las oficinas de la Universidad de Auburn de preboste, el Vicepresidente para la investigación y la escuela de ingeniería de Samuel Ginn. También fue apoyado por la NSF concede CBET-1438211.

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles Corning 16157-191 For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp Home Depot UC953A or equivalent
1/4" female luer to barb Nordson biomedical Nordson FTLL360-6005 1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-244 50'
1/4" in O-rings Grainger 1REC5 #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb Nordson biomedical FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-608 250'
1/8" male spinning luer to barb Nordson biomedical MLRL013-6005
1/8" multiport barb Nordson biomedical 4PLL230-6005 1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb Nordson biomedical 18230-6005 1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer Nordson biomedical Nordson MLRLB230-6005 1/8", PP
10 gallon fish tank Walmart 802262 Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter Dwyer RMA-13-SSV For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank Agrobrite FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter Dwyer RMA-14-SSV For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles Corning 16157-136 For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter Dwyer RMA-12-SSV For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter Dwyer RMA-151-SSV For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm Whatman/ Fisher 09-745-1A Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves VWR 89094-714
Corning lids for pyrex bottles VWR 89000-233 10 GL45 lids
Female luer endcap Nordson biomedical Nordson FTLLP-6005 Female stable PP
Hybridization tubes Corning 32645-030 35×300 mm, pack of 2
Light timer Walmart 556393626
Locknuts Nordson biomedical Nordson LNS-3 1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer VWR 10153-690 Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap Nordson biomedical Nordson LP4-6005 Male plug PP
Spinning luer lock ring Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long VWR 58949-040 38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium VWR 58949-034 25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters VWR 28145-491 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes Air-tite 89215-216 For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes VWR 87003-294 Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes Greiner Bio-One 82050-482 Sterile (or equivalent)
100 mm plates VWR 25384-342 100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes Greiner Bio-One 82050-276 Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips Greiner Bio-One 82051-584 Sterile (or equivalent)
2 mL tubes VWR 87003-298 Sterile (or equivalent)
50 mL tubes Greiner Bio-One 82050-348 Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate Greiner Bio-One 89089-578 Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops VWR 80094-478 Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator Airgas CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes VWR 10158-556 Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates Greiner Bio-One 82050-774 Polypropylene, flat bottom
Bleach Walmart 550646751 Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform BDH BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide BDH BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol BDH BDH1133-1LP
Methanol BDH BDH20864.400
Nile red VWR TCN0659-5G
Pasteur pipette tips VWR 14673-010
Sodium chloride BDH BDH9286-500G
Vegetable oil Walmart 9276383 Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) Biospec products 11079105z
Equipment
Analytical balance Mettler-Toledo XS205DU Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer Omni 19-040E
Benchtop micro centrifuge Thermo Heraeus Fresco 21 with 24×2 Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater VWR 75838-282 Including dry block for a microplate
Freeze dryer Labconco 7670520 2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge Thermo Heraeus Megafuge 16R Tissue Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax M2 Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer VWR 10153-838

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記事を引用
Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T. Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids. J. Vis. Exp. (143), e59106, doi:10.3791/59106 (2019).

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