Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

Desde a Origem das espéciesde Darwin¹, cientistas ganharam profundos insights sobre como traços são dados forma evolutivamente em resposta a pressões ecológicas e ambientais definidas, graças a caverna organismos². O tetra mexicano, a. mexicanus, consiste em olhos populações ‘superfície’ ancestrais que habitam rios em todo o México e sul do Texas e pelo menos 29 populações geograficamente isoladas da caverna derivada morfos que habitam a Sierra del Abra e outras áreas do México nordeste³. Foram identificados vários traços associada a caverna em a. mexicanus, incluindo o consumo de oxigênio alterados, despigmentação, perda de olhos e alterada a alimentação e forrageamento comportamento^{4,5,6, 7,8,9}. A. mexicanus apresenta um poderoso modelo para investigar mecanismos de evolução convergente, devido a uma história evolutiva bem definida, uma caracterização detalhada do ambiente ecológico e a presença de forma independente evoluiu caverna populações de^10,11. Muitos dos traços que estão presentes no cavefish, incluindo perda de olhos, dormir perda, aumentaram a alimentação, perda de escolaridade, reduziram a agressão e reduziram respostas de estresse, evoluíram várias vezes através de origens independentes, muitas vezes utilizando derivados de caverna diferentes vias genéticas entre cavernas^{8,12,13,14,15}. Esta evolução é um aspecto poderoso do sistema da . mexicanus e pode fornecer insights sobre a questão mais geral de sistemas como a genéticas podem ser perturbado para gerar fenótipos similares repetida.

Enquanto a aplicação da tecnologia genética para a investigação mecanicista da função dos genes tem sido limitada em muitas espécies de peixes (incluindo a. mexicanus), avanços recentes no zebrafish fornecem uma base para o desenvolvimento de tecnologia genética em peixes ¹⁶,¹⁷,¹⁸,^19,20. Inúmeras ferramentas são amplamente utilizadas no zebrafish para manipular a expressão gênica, e a implementação desses procedimentos há muito tempo tem sido padronizado. Por exemplo, a injeção de Morpholinos oligos (MOs) na fase de célula única seletivamente bloqueia RNA e impede que a tradução para uma janela temporal breve durante desenvolvimento^21,22. Além disso, gene-edição abordagens, tais como agrupados regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) / CRISPR-associados proteína 9 (Cas9) e nuclease efetoras como ativador de transcrição (TALEN), que permite a geração de exclusões definidas ou, em alguns casos, inserções através de uma recombinação em genomas^19,20,23,24. Transgênese é usada para manipular a expressão de gene estável ou função de uma maneira específica do tipo de célula. O sistema Tol2 é utilizado com eficácia para gerar animais transgénicos por coinjecting transposase mRNA com um plasmídeo de DNA Tol2 contendo um transgene^25,26. O sistema Tol2 utiliza o transposase Tol2 de medaka para gerar inserções germline estável de construct17 transgénicos. Gerar Tol2 transgênicos envolve coinjecting um plasmídeo contendo um transgene ladeado por sites de integração Tol2 e mRNA para Tol2 transposase¹⁷. Este sistema tem sido usado para gerar uma matriz de linhas transgénicas no zebrafish e seu uso se expandiu recentemente para sistemas modelo emergente adicionais, incluindo ciclideos, killies, o pauzinho e, mais recentemente, o mexicano cavefish^{27, 28},²⁹,³⁰.

Enquanto o cavefish é um fascinante sistema biológico para elucidar os mecanismos da evolução do traço, sua capacidade plena como um modelo evolucionista não tem sido totalmente aproveitada. Isto tem sido parcialmente devido a uma incapacidade de manipular genética e celular funcionar diretamente³¹. Genes candidatos regulação complexos traços foram identificados usando estudos de loci (QTL) característica quantitativa, mas a validação destes genes candidatos tem sido difícil³²,^33,34. Recentemente, nocaute transiente usando morpholinos, gene edição usando sistemas CRISPR e TALEN e o uso do Tol2-transgênese mediada têm sido usados para investigar a base genética subjacente a um número de traços,³⁵,³⁶,³⁷ ,³⁸. A implementação e padronização destas técnicas permitirá manipulações que interrogar os fundamentos moleculares e neurais de traços biológicos, incluindo a manipulação da função do gene, a rotulagem de populações de células definidos, e a expressão de repórteres funcionais. Considerando que o sucesso da implementação destas ferramentas genéticas para manipular o gene ou função celular tem sido demonstrada em sistemas modelo emergente, protocolos detalhados ainda são carentes da . mexicanus.

A. mexicanus fornecem a introspecção crítica dos mecanismos da evolução em resposta a um ambiente em mudança e a oportunidade de identificar novos genes regulando diversos traços do presente. Um número de fatores sugere que a. mexicanus é um modelo extremamente tractable para aplicar ferramentas genómicas estabelecidas atualmente disponíveis em modelos genéticos estabelecidos, incluindo a capacidade de facilmente manter peixes nos laboratórios, tamanho grande ninhado, transparência, um genoma sequenciado e ensaios comportamentais definidos³⁹. Aqui, descrevemos uma metodologia para o uso de morpholinos, transgênese e gene edição na superfície e caverna populações da . mexicanus. A aplicação mais ampla dessas ferramentas na . mexicanus permitirá uma investigação mecanicista sobre os processos moleculares subjacentes a evolução das diferenças de desenvolvimento, fisiológicas e comportamentais entre cavefish e peixes de superfície.