概要

Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

Published: February 22, 2019
doi:

概要

Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.

Abstract

Ci sono una varietà di strategie che impiegano batteri patogeni di sopravvivere e proliferare una volta all’interno della cellula eucariotica. I cosiddetti ‘citosolici’ patogeni (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) accedere al cytosol delle cellule infette da fisicamente ed enzimaticamente degradare la membrana vacuolar primaria. Una volta nel cytosol, questi agenti patogeni sia proliferano, nonché generano sufficienti forze meccaniche di penetrare la membrana plasmatica della cellula ospite al fine di infettare nuove cellule. Qui, ci mostrano come questa fase terminale del ciclo cellulare infezione di L. monocytogenes (Lm) può essere quantificata da saggi di unità formanti colonie e citometria a flusso e dare esempi di come sia effetto di fattori patogeno-ospite con codifica e questo processo. Mostriamo anche una stretta corrispondenza delle Lm dinamiche di infezione delle cellule coltivate infettate in vitro e quelli delle cellule epatiche derivate da topi infettati in vivo. Questi saggi basati sulla funzione sono relativamente semplici e possono essere facilmente scalati per schermi di alto-rendimento basata su individuazione per modulatori della funzione delle cellule eucariotiche.

Introduction

Modelli sperimentali basati su infezione sono intrinsecamente impegnativi a causa della loro dipendenza dalle condizioni di partenza dello stato di ospite e patogeno, le varie strategie di infezione del patogeno e la difficoltà di attribuzione dell’agente patogeno e host-processi basati basato sui risultati. Il batterio Listeria monocytogenes (Lm) è diventato un agente patogeno ideale per sondare le risposte di difesa ospite a causa della sua trattabilità genetiche e microbiologiche, la strategia di infezione cellulare rapida e processive e relativamente chiaro relazione tra suoi fenotipi di infezione cellulare e organismica livello. L’infezione cellulare di Lm procede attraverso quattro fasi distinte1: (i) l’invasione cellulare che si conclude con Lm essere racchiuso all’interno di un vacuolo; (ii) Lm-diretto la dissoluzione della membrana del vacuolo e rilascio di Lm nel citosol; (iii) replica intracytosolic; e (iv) penetrazione fisica della membrana plasmatica che si traduce in entrambi l’infezione delle cellule direttamente adiacenti (ad esempio in un foglio di epiteliale) o, in cellule solitarie, rilascio di Lm nell’ambiente extracellulare. Ognuna di queste fasi sono promossi da specifici Lm-codificato fattori (denominati «fattori di virulenza») che, quando eliminato, causare difetti di infezione nei modelli animali e cellulari. Questa strategia di infezione generale è stata evoluta indipendentemente da un numero del cosiddetto ‘citosolico’ patogeni2.

Formanti colonie (CFU) unità saggi sono largamente impiegate per valutare sia in vitro (cioè, cellulare) in vivo (cioè, organismica) esiti di infezione. Oltre alla loro alta sensibilità, specialmente per le infezioni in vivo, CFU saggi forniscono una lettura univoca per l’invasione dell’agente patogeno e sopravvivenza/proliferazione intracellulare. Saggi di CFU sono stati ampiamente utilizzati per analizzare Lm sia host determinanti delle cellule che hanno un impatto infezione. Come informativo come questi studi precedenti sono stati per analizzare l’invasione cellulare e intracytosolic replica, CFU saggi non sono, al meglio della nostra conoscenza, stati utilizzati per tenere traccia della quarta fase del processo di infezione Lm : fuga cellulare. Qui, descriviamo relativamente semplici mezzi di fuga come cellulare (in appresso denominato ’emersione’) possono essere monitorati mediante analisi CFU (così come da citometria a flusso) e visualizza esempi di come entrambi fattori patogeno-ospite con codifica e regolano questa fase di Lm ciclo di infezione. L’analisi della fase terminale del ciclo cellulare Lm infezione può rendere possibile identificare l’agente patogeno supplementare e fattori di infezione specifica cellula ospite e attività.

Protocol

Topi sono stati trattati umanamente secondo tutte le linee guida di governo appropriati per la cura e l’uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e il loro uso è stati approvati per questo intero studio della cura degli animali istituzionale Università di Miami e uso Comitato (protocollo 16-053). 1. preparare le celle per infezione Propagare la linea di macrofago-come delle cellule di topo 264,7 in terreni di coltura di tessuto DMEM completati con 10% di siero…

Representative Results

Valutare il ruolo dell’agente patogeno e codificata in host fattori che incidono infezione cellulareUtilizzando le condizioni di infezione sopra descritte, 0,15% del selvaggio-tipo ingresso Lm viene recuperato dopo 1,5 h di co-incubazione con macrofagi coltivati (Figura 1A). Nei successivi 1,5 h di co-incubazione (3h post infezione, hpi), c’era un aumento di 4 volte nel recupero di vitali Lm e da 3 a 6 h…

Discussion

Grazie al suo programma di infezione cellulare rapida e processive, Lm è un patogeno ideale per sondare le attività cellulari che hanno un impatto infezione. È stata identificata una serie di fattori dell’ospite che positivamente o negativamente influenzare Lm infezione cellulare11,12,13,14. Due tali host fattori caratterizzati nel nostro laboratorio, perforina-2 e l’inibit…

開示

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACK Lysing Buffer Gibco  A1049201
ArC Amine Reactive Compensation Beads  Life Technologies A10346
BHI (Brain Heart Infusion) broth EMD Milipore 110493
Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Collagenase D Roche 11088858001
DMEM media  Gibco  11965-092
FACS tubes  BD Falcon 352054
FBS – Heat Inactivated  Sigma-Aldrich F4135-500ML
Hanks’ Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H6648-6X500ML
LB agar Grow Cells MS MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies L349S9
Rhodamine Phalloidin  Thermo Fischer R415
SP6800 Spectral Analyzer Sony
Syringe 28G 1/2" 1cc BD 329461
TPP Tissue Culture 48 Well Plates  MIDSCI TP92048
TPP Tissue Culture 6 Well Plates  MIDSCI TP92406
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
Antigen
CD11b  Biolegend Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70
CD11c Biolegend Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418
CD45 Biolegend Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80 Biolegend Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead Invitrogen Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100
Ly6C Biolegend Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II Biolegend Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1 Biolegend Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136

参考文献

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記事を引用
Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo, N., Schesser, K. Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (144), e58775, doi:10.3791/58775 (2019).

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